海洋產(chǎn)黃青霉低溫堿性蛋白酶的純化、性質(zhì)分析及其基因的克隆.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)旨在找尋在低溫下有較高酶活但對(duì)中高溫敏感的一種蛋白酶以期應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中來(lái)降低能耗,提高產(chǎn)品質(zhì)量.我們從海底污泥中分離到21株產(chǎn)蛋白酶絲狀真菌,將其中一株產(chǎn)蛋白酶酶活較高的產(chǎn)黃青霉菌株,命名為Penicillium chrysogenum FS010441,對(duì)其生長(zhǎng)的適冷性和它產(chǎn)生的蛋白酶的適低溫特性進(jìn)行了研究,并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化.該菌株能夠在5℃下生長(zhǎng),其最適生長(zhǎng)溫度為20℃,最高生長(zhǎng)溫度低于40℃,為一株適冷菌.在15℃

2、時(shí)其產(chǎn)酶量最高,在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,活力達(dá)到176u/ml.對(duì)該酶進(jìn)行純化及性質(zhì)研究,確定其最適反應(yīng)溫度為35℃,比一般工業(yè)應(yīng)用真菌蛋白酶之最適溫度低10~15℃.該酶熱敏感性強(qiáng),當(dāng)溫度高于50℃時(shí),該酶易失活;60℃保溫5min后只殘存10﹪酶活力,保溫10min后酶活力幾乎完全喪失.但在10℃保溫30min仍然有86﹪酶活殘留.其最適pH為9,在pH8-11范圍內(nèi)活力較高,酶反應(yīng)條件溫和.Ca<'2+>、Mg<'2+>對(duì)酶活

3、力的提高有一定作用,而Cu<'2+>、Co<'2+>對(duì)酶有抑制作用,DEP和PMSF對(duì)酶的抑制作用比較明顯.SDS-PAGE法測(cè)得該酶表觀分子量為41000±1000Da.利用PCR技術(shù),根據(jù)EMBL公開(kāi)的Penicllium chrysogenum基因組DNA序列設(shè)計(jì)合成了PCR所需引物,以Penicllium chrysogenum FS010441染色體DNA為模板,擴(kuò)增出目的基因,構(gòu)建了重組質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)入E.coliDH5α.