丙酮酸脫羧酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體是a-酮酸脫氫酶復(fù)合體家族中重要的一員，它是由丙酮酸脫羧酶(E1)、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(E2)和二氫硫辛酸脫氫酶(E3)三種不同的酶及TPP、硫辛酸、FAD、NAD+、CoA和Mg2+6種輔助因子組裝而成。丙酮酸脫氫酶復(fù)合體在線粒體中催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA，而乙酰CoA再進(jìn)入三羧酸循環(huán)被徹底的氧化分解，從而為生物體的生命活動(dòng)提供必要的能量。丙酮酸脫羧酶參與丙酮酸氧化脫羧過(guò)程中第一步反應(yīng)，這一步是整個(gè)反應(yīng)中唯

2、一的不可逆反應(yīng)。如果此酶的活性受到抑制，則生物體的有氧代謝受阻，導(dǎo)致生物體內(nèi)不能充分地利用氧，細(xì)胞的呼吸作用也會(huì)受到了嚴(yán)重的阻礙。由于氧不能被充分利用，生物體內(nèi)氧會(huì)積累過(guò)多，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的失衡，即增加了活性氧，如超氧陰離子、單線態(tài)氧等。如果這類氧自由基沒(méi)能得到及時(shí)的清除，就會(huì)引起生物膜上的不飽和脂肪酸過(guò)氧化和脫膜脂作用，從而損傷或破壞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如果以丙酮酸脫羧酶為靶標(biāo)的抑制劑能夠強(qiáng)有力地抑制丙酮酸脫羧酶，則導(dǎo)

3、致生物體死亡。但是如何從大量的化合物中篩選出具有高活性的丙酮酸脫羧酶的抑制劑是一個(gè)有待于解決的問(wèn)題。本研究試圖通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建丙酮酸脫羧酶的基因工程菌，通過(guò)其表達(dá)得到大量的丙酮酸脫羧酶；并且建立快速簡(jiǎn)便的分離純化方法，從而制備出大量的純的有活性的丙酮酸脫羧酶，為抑制劑的篩選提供必要的靶標(biāo)酶。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)大腸桿菌丙酮酸脫羧酶(同二聚體類型-a2)進(jìn)行了克隆和表達(dá)。也對(duì)表達(dá)得到的包涵體進(jìn)行了研究。在細(xì)菌破碎之前我們使用了兩種方法

4、對(duì)收集的大腸桿菌進(jìn)行處理，分別在收集的大腸桿菌中加入或者不加入非離子變性劑(SKL)，然后根據(jù)載體(pGEX-KG)的特點(diǎn)采用親和層析的方法得到純化的大腸桿菌丙酮酸脫羧酶，測(cè)活結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者得到的大腸桿菌丙酮酸脫羧酶活力遠(yuǎn)比后者高，其活力達(dá)到348U/ml，而后者活力只有173U/ml。 利用編碼擬蘭芥丙酮酸脫羧酶的a亞基和β亞基的CDS序列分別與水稻的總基因組進(jìn)行序列比對(duì)，得到了與擬蘭芥丙酮酸脫羧酶基因的a亞基和β亞基相對(duì)應(yīng)的同

5、源性都高于90％的兩條序列，并以這兩條序列來(lái)設(shè)計(jì)引物對(duì)水稻丙酮酸脫羧酶(異四聚體類型-a2β2)進(jìn)行了克隆和表達(dá)。利用真核表達(dá)體系——酵母，通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。在通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，分別得到了水稻丙酮酸脫羧酶的a亞基和β亞基，將a亞基和β亞基在體外組裝成有生物活性的丙酮酸脫羧酶進(jìn)行了初步的研究。 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，得到了大腸桿菌的丙酮酸脫羧酶，為今后的以丙酮酸脫羧酶為靶標(biāo)的抑制劑的篩選提供了必要的物質(zhì)保障，也為進(jìn)一步研究丙酮酸脫羧