人抗菌多肽的分離純化、鑒定、cDNA克隆、基因重組及其結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、子宮頸粘液具強(qiáng)大抗細(xì)菌穿透能力,溶菌酶的含量不足以行使其強(qiáng)大抗菌效力,可能存在其它抗菌分子.我們將rIL-2、PHA刺激培養(yǎng)一周的人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(人LAK細(xì)胞)用5﹪的乙酸電動(dòng)勻漿,制備酸溶性粗提物.AU-PAGE電泳及電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測(cè)出人LAK細(xì)胞酸溶性粗提物中含有三組殺菌多肽成分,分別命名為HLP-1、HLP-2、HLP-3三個(gè)組分,利用制備性AU-PAGE電泳技術(shù)初步分離獲得這三個(gè)組分.再將這三個(gè)組分用反向高效液相

2、色譜技術(shù)進(jìn)一步分離純化,收集洗脫液、凍干獲得過柱后各組分.瓊脂糖彌散法篩選經(jīng)RP-HPLC純化的各組分的抗菌活性,較強(qiáng)抗菌活性的組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳初步測(cè)定其分子量及純度.選擇純度大于95﹪的蛋白組分HLP-3P21進(jìn)行電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,采取Edman降解法測(cè)定其氮端氨基酸序列.結(jié)果我們得到HLP-3P21的N-端10個(gè)氨基酸的序列為脯氨酸(Pro,P),賴氨酸(Lys,K),精氨酸(Arg,R),賴氨

3、酸(Lys,K),丙氨酸(Ala,A),谷氨酸(Glu,E),甘氨酸(Gly,G),天冬氨酸(Asp,D)丙氨酸(Ala,A),賴氨酸(Lys,K).將該段氨基酸序列登錄美國國立醫(yī)學(xué)圖書館(NCBI),應(yīng)用Blast檢索工具進(jìn)行短序列匹配的人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn):與該序列100﹪同源的蛋白質(zhì)共有9個(gè),其中一個(gè)為已知人非組蛋白HMG-17,四個(gè)為HMG-17的類似物,另四個(gè)為由人mRNA序列推導(dǎo)的理論蛋白.從人宮頸粘液酸溶性提取物中按上述

4、方法亦分離純化出了一個(gè)抗菌分子HCP,在理化特性及抗菌活性上與前者均有很大的相似性:分子量相近、HPLC出峰時(shí)間相同、均只對(duì)革蘭氏陰性菌有抗菌活性.但因獲得的量很少,未能獲得N-端氨基酸序列資料.將HMG-17進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性、α-跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的分析,找到其疏水區(qū)及α-跨膜螺旋結(jié)構(gòu)主要位于17-47氨基酸殘基區(qū)域,而這一段結(jié)構(gòu)域同時(shí)也是HMG-17分子的DNA結(jié)合區(qū),并且在各種物種中具有高度保守性.因?yàn)棣?跨膜螺旋結(jié)構(gòu)在抗菌肽分子的殺

5、菌效應(yīng)中有重要作用,所以我們分別構(gòu)建了HMG-17及HMG-17α-跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(下面簡(jiǎn)稱HMG-17α)的原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX-1T-HMG17及PGEX-1T-HMG17α,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,進(jìn)行融合表達(dá).融合表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)親和層析純化后,用凝血酶酶切,再經(jīng)AU-PAGE電泳分離分別得到純化的HMG-17和HMG-17α.選用大腸桿菌氨芐青霉素耐藥株ML-35p及綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC65922,測(cè)定HMG-17和HMG-17α的最小