草魚腸道抗菌肽分離純化及部分理化性質(zhì)的研究.pdf

1、抗菌肽是魚體天然免疫體系中的重要組成部分,它屬于非特異性免疫,能夠迅速地在體內(nèi)合成并擴(kuò)散,抵御病原微生物侵害,其反應(yīng)速度是特異性免疫系統(tǒng)所不可比擬的,因此在魚害疾病的防治,魚類品種的改良等方面,抗菌肽能夠開辟出一條新的研究途徑。本試驗(yàn)應(yīng)用SephadexLH-20凝膠層析,RP-HPLC等分離技術(shù)對(duì)草魚腸道抗菌肽進(jìn)行分離純化并對(duì)其基本的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。
　　 1.草魚腸道抗菌肽的分離與純化
　　 本實(shí)驗(yàn)將新鮮草魚腸道

2、經(jīng)充分破碎后,再經(jīng)超聲波處理、5％乙酸浸提,凍干,SephadexLH-20凝膠過濾層析,收集樣品冷凍真空干燥后,以0.1 mol/L乙酸銨溶液作為空白對(duì)照,作抑菌活性檢測(cè),其中具有抗菌活性的成分利用高效液相色譜分析,收集各組分凍干,并用牛津杯擴(kuò)散法及紙片擴(kuò)散法檢測(cè)各組分的抗菌活性。通過改變反相高效液相色譜洗脫條件對(duì)草魚腸道抗菌肽進(jìn)行進(jìn)一步分離,得到純度更高的抗菌肽樣品,純化后抗菌肽冷凍真空干燥,4℃,保存。
　　 2.草魚腸道

3、抗菌肽抗菌活性鑒定及理化性質(zhì)的研究
　　 采用紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)草魚腸道抗菌肽對(duì)致病性大腸桿菌(pathogenicEscherichia coli)、致病性金黃色葡萄球菌(pathogenic Staphyloccocus aureus)、魚致病性沙門氏菌(Salmonella)、魚致病性嗜水氣單胞菌(Aeromonas Hydrophila)、魚害粘球菌(Myxococcus piscicola)、巴氏桿菌(Pasteurel

4、la)、鏈球菌(Streptococcus)等7株細(xì)菌的抗菌作用。結(jié)果表明,草魚腸道抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌作用一般外,對(duì)以上其他6株菌株均有較強(qiáng)的抑制或殺滅作用。
　　 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌與草魚腸道抗菌肽在37℃下作用30 min,掃描電鏡下觀察草魚腸道抗菌肽對(duì)這三株細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示,草魚腸道抗菌肽作用于細(xì)菌細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)菌表面出現(xiàn)囊泡狀或不規(guī)則突起樣結(jié)構(gòu),細(xì)菌嚴(yán)重變形、扭曲、表面變得粗糙、皺縮

5、、胞膜破裂、內(nèi)容物外泄而死。
　　 草魚腸道抗菌肽分別用不同的溫度處理30 min之后,檢測(cè)其抗菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過高溫處理的草魚腸道抗菌肽樣品的抗菌活性基本沒有發(fā)生改變,因此認(rèn)為該抗菌肽具有良好的熱穩(wěn)定性。利用胰蛋白酶對(duì)草魚腸道抗菌肽進(jìn)行酶切16 h,然后通過RP-HPLC系統(tǒng)對(duì)酶切后產(chǎn)物進(jìn)行回收,并做抗菌活性的檢測(cè)。結(jié)果顯示,在經(jīng)過胰蛋白酶酶切后的抗菌肽樣品在RP-HPLC中的保留時(shí)間基本未發(fā)生改變,同時(shí),回收樣品的抗

6、菌實(shí)驗(yàn)中,樣品依然具有很好的抗菌活性,我們可以認(rèn)為該抗菌肽物質(zhì)在蛋白酶作用下,一級(jí)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化,可能是由于該抗菌肽缺乏胰蛋白酶作用位點(diǎn)或者該類抗菌肽具有耐蛋白酶酶切特性。
　　 3.草魚腸道抗菌肽的氨基酸序列分析
　　 通過凝膠層析和反相液相色譜純化得到的草魚腸道抗菌肽樣品進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析,樣品分子量約為2762 Da。蛋白質(zhì)N-端氨基酸序列分析,在預(yù)實(shí)驗(yàn)的過程中,發(fā)現(xiàn)N-端氨基酸序列分析過程中,出現(xiàn)

7、多次Asn、Set、Thr等信號(hào),推斷在該抗菌肽氨基酸序列中存在Asn、Ser、Thr等蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)存在。利用去糖基化試劑盒處理純化得到的抗菌肽樣品進(jìn)行去糖基化處理后回收目的肽,冷凍真空干燥后,進(jìn)行蛋白質(zhì)N-端氨基酸序列分析,得到一條含有30個(gè)氨基酸的N-端序列VKGLVGFAGRRGPPGPRGPVGPAGAKGHQG,通過APD數(shù)據(jù)庫對(duì)該序列進(jìn)行分析和比對(duì),發(fā)現(xiàn)該抗菌肽N-端氨基酸序列與其相似度較高的5種抗菌肽分別是意大利蜂Ap

8、is mellifera L中發(fā)現(xiàn)的ABAECIN,相似度為40.54％,從乳酸菌Lactobacillussalivarius DPC6005、Lactobacillus salivarius subsp.salivarius UCC118中純化得到的Salivaricin P、ABP-118,相似度為36.95％,從白紋伊蚊mosquito,Aedes albopictus中發(fā)現(xiàn)的Cecropin C,相似度為36.84％；從豬唾液