RNAi抑制口蹄疫病毒復制與感染的相關研究.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是20世紀90年代末發(fā)現(xiàn)的一種真核生物細胞在轉(zhuǎn)錄后引發(fā)基因沉默的分子機制，該機制的發(fā)現(xiàn)被美國Science雜志評為2001年世界十大科技進展之首，是近年來分子生物學最引人關注的研究進展。誘發(fā)RNAi的最關鍵分子是長度為19—27個核苷酸的雙鏈RNA，稱作小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，并由一系列蛋白復合物介導，對與之具有序列同源性的基因在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄

2、后、翻譯等水平進行表達調(diào)控。SiRNA可以由細胞內(nèi)源性產(chǎn)生，或者外源性由病毒感染、轉(zhuǎn)座子侵入、或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達。該機制在從酵母到哺乳動物等真核生物中普遍保守，并證明在這些物種中發(fā)揮著發(fā)育調(diào)控、病毒免疫等重要功能。目前，RNAi的分子機制及其功能仍然有待更加細致地闡明，但作為一種反向遺傳學手段已經(jīng)在基因功能研究中廣泛運用，并已作為一種治療策略運用于人類抵抗重大遺傳性疾病和病毒性疾病的研究當中。本文將對RNAi的分子機制，及其抗病毒功能的相關

3、研究作出簡要的概括和展望。 口蹄疫(foot—and-mouthdiseas，F(xiàn)MD)是偶蹄類動物的高度傳染性疾病，引發(fā)FMD的病原體是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的口蹄疫病毒(FlVlDvirus，F(xiàn)MDV)。VPl基因是FMDV的四個結(jié)構蛋白基因之一，在病毒感染過程中該蛋白與易感細胞表面受體結(jié)合，介導病毒對細胞的感染。我們設計并構建了兩個靶向FMDVVPl基因的shRNA表達質(zhì)粒(pNT21矛~pNT63)，首先在BHK-2

4、1細胞中評估了該shRNA表達質(zhì)粒對VPl／綠色熒光蛋白(EGFP)融合報告基因表達的抑制效應，接著在BHK-21細胞和乳鼠動物模型中進一步檢驗了它們的抗病毒活性。結(jié)果表明，當shRNA表達質(zhì)粒與報告基因表達質(zhì)粒(pVP-EGFP-N1)共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞時，報告基因的表達水平降低了80—90％。在病毒攻擊實驗中，轉(zhuǎn)染了shRNA表達質(zhì)粒的BHK-21細胞能夠顯著抵抗1.00個半數(shù)細胞感染劑量(50％tissuecultureinf

5、ectivedose，TCIDso)FMDV的感染，抗病毒效應持續(xù)時間超過48小時。在乳鼠動物模型中，用100微克shRNA表達質(zhì)粒通過頸部皮下注射乳鼠，約80％的動物在6個小時后能夠抵抗20個半數(shù)動物致死劑量(50％animallethaldose，LD50)FMDV的攻擊。此外，我們發(fā)現(xiàn)了一種增強RNAi效應的新途徑，我們構建了一個表達VPl基因mRNA的質(zhì)粒pVPl，將該質(zhì)粒與shRNA表達質(zhì)粒共同注射乳鼠可以顯著提高動物的保護率

6、。實驗結(jié)果暗示，RNAi可能成為預防或治療FMDV感染的可行方法。 發(fā)展RNAi技術使其成為一種可行的FMDV防御策略面臨一個重大的挑戰(zhàn)，那就是RNA病毒普遍具有的高度的遺傳多變性。這里，我們通過序列分析確定了FMDVHKN／2002基因組的5個保守區(qū)(分別是5’NCR、VP4、VPg、POL和3’NCR)，并采用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄長dsRNA、人重組Dicer酶體外剪切的策略獲得雞尾酒siRNA(cocktailsiR

7、NA)。實驗結(jié)果表明，這些siRNA的轉(zhuǎn)染能夠有效降低相應的保守區(qū)基因與EGFP融合基因在BHK一21細胞中的表達水平。在病毒攻擊實驗中，能夠誘導BHK-21細胞對0型同源(HKN／2002)和異源(CHA／99)毒株的交叉抑制，在病毒感染48h檢測到約10-1000倍的抑制效率，而且，抑制效應至少持續(xù)了6天。有趣的是，這些HKN／2002特異性的siRNA還能夠顯著抵抗Asial型病毒YNBS／58的感染，在感染后12、24和48h均

8、檢測到了約10倍的抑制效率，但是該抑制效應最多只能持續(xù)約60h。此外，我們觀察到在事先感染了FMDV的BHK-21細胞中，siRNA的轉(zhuǎn)染對病毒復制的抑制似乎更加有效。我們的實驗結(jié)果表明，靶向病毒基因組保守區(qū)的RNAi是克服病毒遺傳多變性的一種可行的策略。 業(yè)已證明RNAi作為FMDV防御策略在細胞水平是有效的，但是在動物個體水平的有效性仍然有待評估。在這里，我們采用復制缺陷型的人重組腺病毒(Ad5)作為載體構建能夠表達靶向F

9、MDV1D和3D基因shRNA的新型重組腺病毒(分別為Ad5-NT21和Ad5-POL)。實驗證明，Ad5-NT21和Ad5-POL能夠完全保護豬IBRS一2細胞不受同源FMDV毒株的感染，Ad5-POL還能夠抵抗異源FMDV毒株的感染。接著我們利用豚鼠作為動物模型，評估了新型重組腺病毒在動物個體內(nèi)對FMDV感染的抑制效應，結(jié)果表明，每頭豚鼠肌肉注射10。PFU劑量Ad5-POL，在面對24h后50IDs。同源FMDV攻擊時，有3／5的

10、動物沒有明顯的口蹄疫疾病癥狀(即在腳掌發(fā)生病毒性水泡)；但是，兩次免疫、或者提高重組腺病毒的劑量、或者同劑量Ad5-NT21／Ad5-POL混和注射等對免疫方法簡單地進行改進并不能提高對動物的保護效率；令人。驚訝的是，Ad5-NT21／Ad5-POL的混和注射使豚鼠能夠即刻有效地抵抗50ID50同源FMDV攻擊，這暗示腺病毒介導的RNAi能夠十分快速地抑制病毒的復制。以豚鼠動物模型的抗病毒實驗數(shù)據(jù)為參照，我們進一步以易感動物而且也是主要

11、的經(jīng)濟型動物之一的家豬作為對象，評估了重組腺病毒的抗病毒潛力，結(jié)果顯示，給家豬頸部肌肉注射4×10'PFU劑量Ad5-NT21/Ad5-POL混合腺病毒，有2／3的豬能夠抵抗24h后100IDso同源FMDV的攻擊而不發(fā)生任何明顯的口蹄疫疾病癥狀。Ad5-NT2l和Ad5-POL的抗病毒潛力是特異的，因為作為對照的能夠表達靶向大腸桿菌LacZ基因shRNA的重組腺病毒Ad5-LacZ沒有任何顯著的抗病毒活性。 絕大多數(shù)真核生物

12、細胞擁有一套由dsRNA誘發(fā)的對具有序列同源性的mRNA產(chǎn)生表達抑制效應的分子機制，稱為RNA沉默(RNAsilencing)。大量的研究資料表明，RNA沉默是植物和無脊椎動物細胞主要的病毒防御機制。近年來發(fā)現(xiàn)，該分子機制也十分保守地存在于哺乳動物細胞當中，盡管哺乳動物細胞誘發(fā)的RNA沉默反應的能力似乎比植物或無脊椎動物細胞有所減弱。由于脊椎動物具備一套完善的蛋白質(zhì)水平的免疫系統(tǒng)(protein-basedimmunesystem)，因

13、此，在脊椎動物細胞中發(fā)現(xiàn)RNA沉默分子機制使科學界對脊椎動物病毒防御機制的發(fā)展進化有了更新的認識。我們認為，脊椎動物擁有的另一套病毒防御機制——干擾素系統(tǒng)(IFNsystem)可能是真核生物免疫系統(tǒng)從RNA沉默進化到蛋白質(zhì)免疫過程當中的中間產(chǎn)物；干擾素系統(tǒng)的出現(xiàn)可能解釋了RNA沉默機制在脊椎動物細胞中的弱化以及蛋白質(zhì)免疫系統(tǒng)的發(fā)展與成熟。此外，我們在本文中亦強調(diào)，RNA沉默機制的發(fā)現(xiàn)為人類更深地了解脊椎動物病毒防御機制乃至生命進化提供一