甘草酸18位差向異構體及其水解產物對P-糖蛋白影響的研究.pdf

1、甘草酸(glycyrrhizic acid,GL)是甘草中最主要的活性成分,水解后產生二分子葡萄糖醛酸(glcuronic acid)和一分子甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)。由于三萜皂苷母核18位手性碳原子(C-18)構型的不同,甘草酸存在一對差向異構體,即18α-甘草酸(α-GL)和18β-甘草酸(β-GL),兩者水解后可生成相應的18α-甘草次酸(α-GA)和18β-甘草次酸(β-GA)。早期對甘草酸、甘草

2、次酸的研究大多沒有將兩個異構體明確區(qū)分,但隨著具有我國自主知識產權的“手性肝藥”異甘草酸鎂在2006年上市,甘草酸18位差向異構體的差異日益受到國內外學者的關注。從藥物轉運的角度,本文研究了甘草酸18位差向異構體及其水解產物對P-糖蛋白的影響。
　　 目的：
　　 研究甘草酸18位差向異構體及其水解產物對P-gp功能和表達的影響,探討其對P-gp的作用是否具有立體選擇性;通過研究甘草酸18位差向異構體水解產物在Caco-

3、2細胞上對P-gp底物轉運的影響,進一步確證功能和表達實驗結果;通過研究甘草酸制劑對他林洛爾藥動學的影響,初步探討甘草酸制劑與P-gp底物在臨床上可能發(fā)生的相互作用。
　　 方法：
　　 1.RP-HPLC法分離并測定甘草酸制劑中的18α-、18β-甘草酸采用Phenyl-Hexyl(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱,流動相為10 mmol·L-1醋酸銨溶液(pH=7.75)-乙腈(83:17),流速1.0 m

4、L/min,柱溫38℃,檢測波長250 nm。
　　 2.細胞培養(yǎng)及單層模型的建立
　　 采用MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)Caco-2細胞、臍靜脈內皮細胞(ECV304),用于研究甘草酸18位差向異構體及其水解產物對P-gp功能和表達的影響。采用苯基溴化四氮唑藍法(MTT),判斷各試驗藥物的體外最大非細胞毒性劑量,保證試驗過程中細胞的活性,并為甘草酸18位差向異構體及其水解產物對P-gp功能和表達以及P-gp底物轉運影響的研究提

5、供與細胞作用的最大濃度。
　　 3.羅丹明123攝取實驗研究藥物對P-go功能的影響
　　 以ECV304細胞作陰性對照細胞,維拉帕米作為抑制P-gp功能的陽性對照,使用流式細胞術測定羅丹明123(Rho-123)熒光值,分析甘草酸18位差向異構體及其水解產物對P-gp底物—Rho-123被Caco-2細胞攝取的影響,以此反映P-gp功能的變化。
　　 4.實時熒光定量PCR檢測MDR1 mRNA表達
　　

6、 以環(huán)孢素A作為上調MDR1mRNA表達的陽性對照,不加藥處理的Caco-2細胞作為陰性對照,Real-time PCR檢測MDR1 mRNA,研究甘草酸18位差向異構體及其水解產物對MDR1mRNA表達的影響。
　　 5.流式細胞術和Western blot檢測P-gp蛋白表達
　　 以環(huán)孢素A作為誘導P-gp蛋白表達的陽性對照,不加藥處理的Caco-2細胞作為陰性對照,采用流式細胞術(FCM)和Western bl

7、ot分別研究a-GL和β-GL、α-GA和β-GA對P-gp蛋白表達的影響。
　　 6.Caeo-2細胞單層模型上P-gp轉運實驗
　　 在TranswellTM12孔板上建立Caco-2細胞單層模型,使用酶標儀測定轉運液中Rho-123的濃度,分別考察藥物瞬時作用下對Rho-123雙向轉運的影響以及藥物干預72 h后Rho-123雙向轉運的變化。HPLC測定轉運液中他林洛爾的濃度,進一步在Caco-2細胞單層模型上考察

8、藥物干預72 h后他林洛爾外向轉運的變化。
　　 7.甘草酸制劑對他林洛爾藥動學的影響
　　 采用2×2雙交叉試驗設計。14名受試者隨機等分為2組,一組先服用復方甘草酸苷片6天,每天三次,每次三片,第7天服用他林洛爾片1片,即試驗組:另一組先服用安慰劑6天,每天三次,每次三片,第7天服用他林洛爾片1片,即對照組。受試者服藥前及服藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、16和24 h取

9、靜脈血5 mL,置肝素化離心管中,分離出血漿,置-70℃冰箱中保存待測。采用HPLC法測定血漿中他林洛爾的濃度。使用DAS2.1.1軟件計算藥動學參數,SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　 結果與結論：
　　 1.各制劑中α體和β體甘草酸的組成比各不相同,亟待制定甘草酸制劑中異構體含量的相關質量標準。
　　 2.α-GL、β-GL對P-gP的影響作用方向呈現相反的趨勢。中、高濃度(10μmol·L-1、60μ

10、mol·-1)α-GL對P-gP功能表現出抑制作用,但沒有呈現出劑量依賴性。Β-GL各濃度對P-gp功能表現出誘導作用,也沒有表現出劑量依賴性;中、高濃度(10μmol·L-1、60μmol·L-1)α-GL下調MDR1 mRNA表達,β-GL只在高濃度(60μmol·L-1)上調了MDR1mRNA表達;高濃度(60μmol·L-1)β-GL在蛋白水平對P-gP有誘導作用,α-GL各濃度沒有表現出對P-gP表達的影響。轉錄水平上α-GL

11、、β-GL對P-gP的影響與α-GL、β-GL對CYP3A的影響呈現一定的同向性,甘草酸18位差向異構體對CYP3A與P-gP的影響有相似的立體選擇性,其機制是否與孕烷X受體(PXR)有關,有待進一步研究。
　　 3.α-GA、β-GA對P-gP的作用可能存在程度上的差別,而且18α-、18β-甘草次酸對P-gP的影響與其母體甘草酸的作用趨勢并不一致。中、高濃度(1μmol·L-1、10μmol·L-1)α-GA對P-gP功能表

12、現出誘導作用,并呈現出劑量依賴性。高濃度(10μmol·L-1)β-GA對P-gP功能表現出誘導作用;高濃度(10μmol·L-1)α-GA上調MDR1 mRNA表達,實驗濃度β-GA未影響MDR1 mRNA的表達;高濃度(10μmol·L-1)α-GA在蛋白水平對P-gP有誘導作用,實驗濃度β-GA沒有表現出對P-gp表達的改變。甘草酸苷水解后與其苷元甘草次酸對P-gP的影響存在區(qū)別,其機制有待進一步研究。
　　 4.P-gP

13、底物轉運試驗中,高濃度(10μmol·L-1)α-GA瞬時作用于Caco-2細胞單層模型,或者干預單層模型72 h后,均能誘導P-gp底物Rho-123外向轉運;高濃度(10μmol·L-1)β-GA瞬時作用于Caco-2細胞單層模型沒有表現出誘導作用,但在干預Caco-2單層模型72 h后,表現出對Rho-123外排的誘導;他林洛爾的外向轉運受α-GA、β-GA干預72 h后的影響與Rho-123受α-GA、β-GA干預72 h的結果

14、相似。Α-GA誘導P-gP底物外排的能力比β-GA強。鑒于α-GA、β-GA對Caco-2細胞干預72 h后均能不同程度的促進P-gP底物Rho-123和他林洛爾的外向轉運,甘草酸上調MDR1,誘導外源性物質的外排,可能是甘草解毒的機制之一。
　　 5.他林洛爾藥動學試驗表明,復方甘草酸苷沒有增加他林洛爾的不良反應,總體上也沒有對其藥動學產生影響。但有可能是因為樣本數量不夠多、群體的個體差異而使藥動學參數改變沒有表現出統(tǒng)計學意義

15、。也有可能是試驗設計服用復方甘草酸苷的時間不夠長,未能產生對腸道P-gp的誘導。雖然國內外多數研究采用了他林洛爾作為P-gp相關人體試驗的探針藥物,其是否能準確反映P-gp的變化情況,有待進一步確證。鑒于本研究體外實驗發(fā)現α-GA可能比β-GA有更強的誘導P-gp的能力,α體甘草酸制劑對P-gp底物藥動學的影響有待進一步研究,并且由于純α體甘草酸制劑臨床應用時間還不長,臨床上與其他藥物同時使用時,應注意觀察是否有藥物相互作用的發(fā)生。