中國(guó)石斛屬系統(tǒng)發(fā)育及鐵皮石斛的保護(hù)遺傳學(xué)研究.pdf

1、石斛屬(Dendrobium)為蘭科(Orchidaceae)第二大屬，我國(guó)有74種2變種，經(jīng)典的形態(tài)分類系統(tǒng)對(duì)該屬下組的劃分存在著一些爭(zhēng)議。本研究首先根據(jù)rDNAITS序列對(duì)中國(guó)62種石斛屬植物涵蓋了12個(gè)組的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行了探討，構(gòu)建了NJ和MP兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明：由禾葉組的雙花石斛和小雙花石斛組成了最基部的一支，剩余的60種則分為兩大支，其中，距囊組、基腫組、劍葉組和草葉組這4個(gè)組構(gòu)成了一支，另外一支則由石斛組、黑毛組、叉

2、唇組、頂葉組、瘦軸組、圓柱葉組、心葉組和和葉組構(gòu)成。且第二大支中，存在著組與組之間的物種相混雜在一起的現(xiàn)象，這可能是由于石斛組物種繁多且親緣關(guān)系不明確導(dǎo)致的。這一現(xiàn)象預(yù)示少數(shù)按照經(jīng)典形態(tài)特征劃分的組與分子系統(tǒng)沒(méi)有呼應(yīng)，個(gè)別分組尚待商榷。
　　 鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為蘭科石斛屬植物，是我國(guó)特有的珍稀瀕危物種。鐵皮石斛是一種傳統(tǒng)名貴中藥，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳、潤(rùn)喉明目的功效。鐵皮石斛自然

3、繁殖率低，加上長(zhǎng)年無(wú)節(jié)制的采挖，該物種已經(jīng)日趨枯竭。因此，亟待需要開(kāi)展鐵皮石斛的種質(zhì)資源與保護(hù)遺傳學(xué)的研究。本論文開(kāi)展了鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究、遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的研究，旨在為合理利用及保護(hù)鐵皮石斛資源提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)于保護(hù)和利用該瀕危物種有著重要的意義。
　　 本研究采用不同的基本培養(yǎng)基，添加各種濃度比例的激素，對(duì)鐵皮石斛莖段誘導(dǎo)側(cè)芽及叢生芽展開(kāi)了研究。采用三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)了9組試驗(yàn)，誘導(dǎo)叢生芽的產(chǎn)生，統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖

4、系數(shù)，篩選出鐵皮石斛莖段誘導(dǎo)芽的最優(yōu)配方組合。
　　 為探討鐵皮石斛遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)，本論文通過(guò)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，對(duì)12個(gè)居群的71個(gè)鐵皮石斛個(gè)體展開(kāi)研究。經(jīng)過(guò)4對(duì)選擇性引物擴(kuò)增后共得到192條條帶，所得條帶范圍是100-500bp。結(jié)果表明，鐵皮石斛在種的水平上擁有較高的遺傳多樣性，其中多態(tài)性條帶有164條，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPL)為85.42％，香農(nóng)信息指數(shù)(IS)為0.4100，期望雜合度(He)為

5、0.2688。
　　 但居群水平上多樣性則偏低(PPL=40.82％，IS=0.2203，He=0.1477)。AMOVA分析表明居群內(nèi)的變異占主要部分，約有73.03％變異發(fā)生在居群內(nèi)部，而居群間的變異占總變異的26.97％。UPGMA聚類樹(shù)上看，廣西樂(lè)業(yè)居群與其他11個(gè)居群的遺傳距離最遠(yuǎn)，成為最基部的一支。其余居群分成2個(gè)大支，第一大支中的居群主要分布與我國(guó)西南部省份，而第二大支中的居群則主要分布于我國(guó)東南部省份，與PCO分

6、析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。另外，PCO分析還表明，不同居群的個(gè)體間有相互重疊和相互混雜的現(xiàn)象，而這一現(xiàn)象就恰好說(shuō)明個(gè)體間的遺傳關(guān)系與他們的空間分布上缺少明顯的關(guān)聯(lián)，與Mantel test檢測(cè)的結(jié)果相呼應(yīng)。自交不親和，較為廣泛的地理分布和較長(zhǎng)的生命期限可能是其擁有較高遺傳多樣性的原因。分化指數(shù)ΦST表明鐵皮石斛居群間存在有中等水平的遺傳分化。居群間的基因流Nm值為0.67，基因流小于1，將不足以抵制潛在的遺傳漂變可能帶來(lái)的后果。
　　

7、本論文還對(duì)鐵皮石斛的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了開(kāi)發(fā)。利用磁珠富集法構(gòu)建鐵皮石斛微衛(wèi)星文庫(kù)，篩選出有效的SSR標(biāo)記，共獲得8對(duì)多態(tài)性引物。通過(guò)對(duì)3個(gè)居群的15個(gè)個(gè)體的擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)：每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目為2-4個(gè)，多態(tài)信息含量PIC為0.357-0.671，期望雜合度為0.480-0.747，說(shuō)明鐵皮石斛擁有較高的遺傳多樣性。
　　 遺傳分化系數(shù)（Fst）反映出這三個(gè)鐵皮石斛居群的分化處于中度分化程度。鐵皮石斛微衛(wèi)星的開(kāi)發(fā)為進(jìn)一步研究其保護(hù)遺傳