小鼠Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分，Tbx18-Cre基因敲入小鼠Cre重組酶保真性研究
　　目的：揭示Tbx18-Cre基因敲入小鼠中Cre重組酶表達(dá)的保真性。
　　方法：利用實(shí)時熒光定量PCR法快速檢測不同基因型小鼠中Cre基因的相對拷貝數(shù)差異及Tbx18下游基因表達(dá)情況；運(yùn)用Junction PCR及基因測序驗(yàn)證Tbx18-Cre基因敲入小鼠中Tbx18-Cre整合位點(diǎn)的特異性；利用原位雜交，X-gal染色及EYFP熒光揭示Tbx18的譜系示蹤

2、及Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的分化命運(yùn)。
　　結(jié)果：不同基因型小鼠中Cre基因的相對拷貝數(shù)表達(dá)準(zhǔn)確，Tbx18-Cre整合位點(diǎn)特異，Cre重組酶特異阻斷Tbx18轉(zhuǎn)錄表達(dá)導(dǎo)致其下游基因CX40及CX43表達(dá)量在Tbx18 Cre-Cre基因敲入小鼠模型中明顯高于野生型C57BL/6小鼠，Tbx18-Cre/Rosa26R-LacZ雙雜合小鼠中LacZ蛋白表達(dá)部位在胚胎發(fā)育早中期與運(yùn)用Tbx18 cRNA進(jìn)行原位雜交所顯示的雜交信號部

3、位一致，譜系示蹤揭示Tbx18+心外膜祖細(xì)胞可以遷移并分化形成部分心肌組織。
　　結(jié)論：Tbx18-Cre基因敲入小鼠中Cre重組酶的表達(dá)具有高度保真性及時空特異性，至今未發(fā)現(xiàn)Cre遺漏現(xiàn)象。
　　第二部分，小鼠Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化潛能的研究
　　目的：揭示小鼠Tox18+心外膜祖細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化的潛能。
　　方法：在體外培養(yǎng)細(xì)胞水平及體內(nèi)組織學(xué)水平利用Tox18-Cre/Rosa

4、26R-EYFP雙雜合示蹤小鼠模型對EYFP+細(xì)胞及組織進(jìn)行譜系示蹤，并應(yīng)用血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物Myh11進(jìn)行細(xì)胞及組織免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察；應(yīng)用Ybx18-Cre/Rosa26R-LacZ雙雜合小鼠模型進(jìn)行心臟組織X-gal染色后觀察LacZ蛋白表達(dá)細(xì)胞及組織形態(tài)。
　　結(jié)果：在細(xì)胞水平及組織水平EYFP+細(xì)胞及組織與Myh11共聚焦，X-gal染色陽性組織與心臟血管平滑肌結(jié)構(gòu)一致。
　　結(jié)論：Tbx18+心外膜