高糖誘導的NETs在糖尿病腎病中的作用及機制研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病是目前導致終末期腎病最主要的原因，但其具體發(fā)病機制尚不明確。中性粒細胞胞外網(wǎng)絡（NETs）是中性粒細胞對抗外源性刺激物的一種防御機制。研究發(fā)現(xiàn)NETs在肺纖維化、痛風、哮喘、糖病足等疾病的進程中發(fā)揮了重要作用，但其是否參與了糖尿病腎病的發(fā)生及其機制還未闡明。本研究旨在探索NETs在糖尿病腎病中所發(fā)揮的作用及其機制。
　　方法：在動物實驗中，采用一次性腹腔下注射鏈脲酶素（STZ）150mg/Kg建造糖尿病小鼠模型。常

2、規(guī)喂養(yǎng)32周后收集尿液采用化學酶促法檢測UACR以確定糖尿病腎病模型是否構建成功，并處死小鼠后收集腎臟組織。收集血糖正常及糖尿病腎病的腎臟腫瘤患者的瘤旁組織（距腫瘤5cm處）。PAS染色及天狼星紅染色觀察糖尿病腎病的小鼠與人的腎臟結構損傷情況和腎臟纖維化程度，免疫組織化學檢測NETs相關標志物MPO、Cit-Histone3以及腎小管區(qū)域的上皮間質轉化情況。在體外實驗中，使用25mmol/L的高糖培養(yǎng)基干預人中性粒細胞，Sytox Gr

3、een染色觀察NETs產(chǎn)生情況，并采用dsDNA Quantitfy Kit對NETs定量。進一步采用高糖誘導的NETs干預HK2人腎小管上皮細胞24h后，Western Blot檢測E-Cadherin、SMA、Snail、ZEB的表達以判斷細胞是否發(fā)生了上皮間質轉化（EMT）。
　　結果：⑴在小鼠糖尿病腎病模型中，STZ組小鼠UACR較對照組顯著上升（4.421±0.351 mg/ml VS3.298±0.187 mg/ml）

4、，差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。PAS染色顯示STZ組小鼠的腎臟結構明顯改變，小管區(qū)域基底膜增厚擴張、糖原沉積。天狼星紅染色染色表明STZ組較對照組膠原纖維沉積顯著增多，STZ組腎臟明顯纖維化。免疫熒光染色顯示STZ組NETs標志物MPO、Cit-Histone3沉積明顯增多，免疫組化顯示STZ組小鼠腎小管區(qū)域E-Cadherin表達明顯下調、 -SMA表達顯著上調，提示腎臟發(fā)生了上皮間質轉化。⑵在人糖尿病腎病組織中，天狼星紅染色

5、顯示腎臟纖維化明顯增加，免疫熒光染色顯示NETs標志物MPO、Cit-Histone3沉積明顯增多，免疫組化顯示腎小管區(qū)域E-Cadherin表達明顯下調、SMA表達顯著上調。⑶在體外實驗中，Sytox-Green熒光染色顯示高糖可誘導中性粒細胞產(chǎn)生NETs。Western Blot顯示高糖誘導的NETs干預人腎小管上皮細胞后E-Cadherin蛋白顯著下調，-SMA、Snail、ZEB蛋白顯著上調。
　　結論：NETs在糖尿病腎