巴馬小型豬體細(xì)胞核移植和食蟹猴-豬異種體細(xì)胞核移植相關(guān)問(wèn)題的初步研究.pdf

1、本研究主要探討巴馬小型豬體細(xì)胞核移植和食蟹猴一豬異種核移植的相關(guān)技術(shù)問(wèn)題。本論文包括兩大部分，第一部分是文獻(xiàn)綜述，第二部分是試驗(yàn)研究。試驗(yàn)研究包括：(一)豬和食蟹猴體細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立：(二)巴馬小型豬體細(xì)胞核移植體系的建立；(三)PHA對(duì)孤雌激活和體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育的影響；(四)豬體細(xì)胞核移植胚胎移植方法的建立；(五)食蟹猴-豬異種核移植的初步研究。試驗(yàn)研究的方法和結(jié)果可歸納為如下幾點(diǎn)： 1．建立巴馬小型豬睪丸成纖維細(xì)胞、耳

2、部成纖維細(xì)胞、普通豬胎兒成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，并探討其作為豬體細(xì)胞核移植供體的可能性。使用酶消化和組織塊法成功分離培養(yǎng)了睪丸成纖維細(xì)胞，鑒定了其細(xì)胞類型，并且對(duì)其細(xì)胞周期與核心組蛋白(H3K9)乙?；年P(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該培養(yǎng)體系可以支持上述幾種細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。免疫熒光染色鑒定所分離到的細(xì)胞為睪丸成纖維細(xì)胞。兩種同期化方法(血清饑餓和接觸抑制)的結(jié)果顯示：隨著血清饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)G0+G1細(xì)胞的比例急劇升高后又趨于穩(wěn)

3、定，2d、4d組與70-80％匯合組差異顯著(75.9％，95.9％vs.95.2％，P<0.05)，但2d、4d組差異不顯著：細(xì)胞隨著匯合度的增加G0+G1細(xì)胞的比例開(kāi)始上升，接觸抑制兩天后基本趨于穩(wěn)定，2d組、4d和6d組顯著高于70-80％匯合組和100％匯合組(97.3％，95.0％，97.4％vs.74.7％，84.2％，P<0.05)。流式細(xì)胞儀分析顯示：無(wú)論是血清饑餓還是接觸抑制處理，G0/G1期供體細(xì)胞組蛋白乙?；阶?/p>

4、化趨勢(shì)基本相同，基本上是先升高后又降低。 2．建立了食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，并探討其作為猴同種體細(xì)胞核移植或異種體細(xì)胞核移植供體的可能性。分別使用酶消化和組織塊法分離到了食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞，間接免疫熒光法鑒定了其細(xì)胞類型并進(jìn)行了核型分析。結(jié)果表明：該培養(yǎng)體系可以很好地支持該種細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，目前已傳代到43代，生長(zhǎng)仍旺盛；免疫熒光染色鑒定分離到的細(xì)胞為耳部成纖維細(xì)胞；對(duì)21代的細(xì)胞進(jìn)行核型分析，核型正常。

5、3．本試驗(yàn)的目的是:A.掌握豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中第一極體的位置隨時(shí)間發(fā)生偏移的規(guī)律，為提高盲吸法去核效率提供依據(jù)；B.初步探討胎兒成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞核移植效率；C.胚胎培養(yǎng)時(shí)添加胰島素對(duì)孤雌激活和顆粒核移植胚胎發(fā)育率的影響；D.探討簡(jiǎn)易融合儀對(duì)孤雌激活和體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果表明：在44-46h，有84.7％的極體位置偏移不超過(guò)30°，盲吸法的去核率基本與之對(duì)應(yīng)，平均在88.1％，適于在本段時(shí)間進(jìn)行去核。胎兒成纖維細(xì)胞、

6、顆粒細(xì)胞核移植胚胎的囊胚率分別為9.9％和8.7％。Insulin無(wú)論對(duì)于顆粒細(xì)胞核移植胚胎(8.0％vs.2.4％，P>0.05)，還是孤雌激活胚胎均無(wú)顯著促進(jìn)作用(47.3％vs.44.3％，P>0.05)，但孤雌激活胚胎的囊胚顯著高于核移植胚胎(47.3％和44.3％vs.8.0％和2.4％，P<0.05)。簡(jiǎn)易融合儀下，對(duì)于核移植胚胎，場(chǎng)強(qiáng)為200v/mm組的桑椹胚發(fā)育率均高于220v/mm組(33.3％，29.6％vs.17.

7、1％，13.8％，P>0.05)：場(chǎng)強(qiáng)一定時(shí)，20μs組的桑椹胚率均高于40μs組．。隨著場(chǎng)強(qiáng)的升高和脈沖時(shí)間的延長(zhǎng)，桑椹胚發(fā)育率呈下降趨勢(shì)。對(duì)于孤雌激活胚胎，20μs組的分裂率和囊胚率均高于40μs組，但差異不顯著。 4．對(duì)睪丸成纖維細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓和接觸抑制處理，尋找適宜的同期化方法，同時(shí)探討了高代睪丸成纖維細(xì)胞重構(gòu)胚胎的核重塑的規(guī)律，并比較了高代、低代睪丸成纖維細(xì)胞和耳部成纖維細(xì)胞重構(gòu)胚胎的發(fā)育率。結(jié)果顯示：接觸抑制法處理

8、供體，核移植胚胎融合率顯著高于血清饑餓法(68．6％vs.55.3％，P<0.05)，胚胎囊胚率也高于后者(21.1％vs.14.1％；P>0.05)，但差異不顯著：重構(gòu)胚胎激活后3h，供體核的大小基本不發(fā)生變化，激活后6h，絕大多數(shù)重構(gòu)胚形成膨大的類原核，到12h時(shí)，幾乎所有重構(gòu)胚形成膨大的類原核，并開(kāi)始觀察到重構(gòu)胚分裂現(xiàn)象;低代睪丸成纖維細(xì)胞和耳部成纖維作為供體細(xì)胞時(shí)，重構(gòu)胚胎的融合率均顯著高于高代睪丸成纖維細(xì)胞(84.4％，79.

9、1％vs.69.2％，P<0.05)，前兩者的重構(gòu)胚融合率也差異顯著(84.4％vs.79.1％，P<0.05)，低代睪丸成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞時(shí)重構(gòu)胚胎的囊胚率顯著高于高代睪丸成纖維細(xì)胞和耳成纖維細(xì)胞(13.9％，8.9％vs.6.4％，P<0.05)。 5．探討了植物凝集素(PHA)對(duì)于化學(xué)激活、電激活孤雌激活胚胎和體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果表明：添加適量PHA可以提高化學(xué)激活胚胎的囊胚率，10μg/mlPHA可以

10、使囊胚率提高到54.1％：加入量大則有害；添加10μg/ml，20μg/ml的PHA可以顯著提高體細(xì)胞核移植囊胚發(fā)育率(13.0％，5.6％Vs.5.0％，P<0.05)，10μg/ml組的囊胚率比對(duì)照組提高1倍多?？傊?，PHA對(duì)于化學(xué)激活、電激活和體細(xì)胞核移植胚胎的作用呈劑量依賴性，適量添加有助于三種胚胎的發(fā)育，過(guò)量則有害。 6．以胎兒成纖維細(xì)胞和新生巴馬小型豬睪丸成纖維細(xì)胞為供體構(gòu)建的重構(gòu)胚胎，利用刺入式胚胎移植法將其分別移

11、入兩頭巴馬小型豬和兩頭陸川豬的輸卵管內(nèi)。其中兩頭巴馬小型豬和一頭陸川豬返情，一頭陸川豬懷孕到期，產(chǎn)下一頭健康的雄性巴馬小型豬。說(shuō)明新生巴馬小型豬睪丸成纖維細(xì)胞核移植胚胎可以發(fā)育到期。 7．采用食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞作為核供體構(gòu)建猴一豬異種核移植胚胎，研究其核重編機(jī)制并尋找適宜的培養(yǎng)基，初步建立食蟹猴一豬異種核移植體系。結(jié)果顯示：(1)重構(gòu)胚胎激活后3h，供體核的大小基本不發(fā)生變化，但在激活后6h大部分形成膨大的類原核。(2)食蟹猴

12、一豬異種核移植胚胎融合率為74.2％，有70.5％的重構(gòu)胚胎發(fā)生卵裂，29％的卵裂胚胎發(fā)育到桑椹胚階段。(3)NCSU23+10％FCS和TCM199+10％FCS培養(yǎng)基中，重構(gòu)胚突破4-細(xì)胞阻滯發(fā)育到8-細(xì)胞以上的比例分別為23.5％和17.0％，NCSU23培養(yǎng)基為19.9％，但是只有在NCSU23+10％FCS和TCM199+10％FCS培養(yǎng)基中重構(gòu)胚胎可以發(fā)育到囊胚階段(1.4％vs.1.1％，P>0.05)，盡管差異不顯著。