增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、目的：為研究增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因在活細(xì)胞中作為報告基因和篩選標(biāo)記的可行性，特構(gòu)建其真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)-EGFP，并將它轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)中，觀察其在這兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法：以BamHⅠ和NotⅠ雙酶切分別從真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)和EGFP載體pEGFP-1中切取線性化pCDNA3.1(+)載體和目的EGFP基因片段，然后將兩者連接起來，從而獲得重組質(zhì)粒pCD

2、NA3.1(+)-EGFP，并分別以BamHⅠ單酶切和BamHⅠ、NotⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE2000分別將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的Hela細(xì)胞和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，分別經(jīng)G418篩選兩周和四周后獲得EGFP陽性克隆，進(jìn)行細(xì)胞爬片后放置在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)論：EGFP基因能以真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)-EGFP的形式在Hela細(xì)胞和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成功表達(dá)，并發(fā)出綠色熒光，而