人溶菌酶基因乳腺特異性表達載體的構建及其在小鼠乳腺癌細胞中的表達.pdf

1、人溶菌酶(humanlysozyme，hLYZ)參與機體的防御機制，有抗感染、抗腫瘤和免疫調節(jié)的作用，因此在醫(yī)學、食品工業(yè)等領域得到十分廣泛的應用。天然hLYZ一般是從人乳、中性粒細胞或尿液中少量提取，但由于來源極其困難，提取方法復雜，且安全性得不到保障，不能進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。轉基因動物乳腺生物反應器具有表達水平高、表達產(chǎn)物活性強、易于純化和無污染等優(yōu)點，是大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的新途徑。 因此，本研究以奶牛β-酪蛋白基因調控

2、區(qū)為指導元件，以人溶菌酶(hLYZ)cDNA為表達序列，構建了乳腺特異性表達載體pEBH。轉染小鼠乳腺癌細胞EMT6，篩選獲得穩(wěn)定表達株，并對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析及Westernblot檢測。相關結果如下： 1.通過RT-PCR技術成功的從人胎盤組織中擴增出長度為853bp的hLYZ基因cDNA，包含完整的編碼序列。經(jīng)序列分析表明，片段與GenBank中登錄的人hLYZcDNA序列的同源性為99％。在讀碼框內(nèi)，只有

3、三個堿基發(fā)生點突變。但分析表明，這三處突變不影響蛋白質功能。 2.利用定向克隆的方法，將hLYZ表達序列與改造好的初級乳腺表達載體pBCP融合在一起，然后定向克隆至真核表達載體pEGFP-C1中，最終構建了含有抗性基因和綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的hLYZ非融合型乳腺特異性表達載體pEBH。 3.通過脂質體法將表達載體pEBH轉入體外培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細胞EMT6，經(jīng)G418抗性篩選，得到的陽性細胞可穩(wěn)定地表達綠