暗黑鰓金龜幼蟲腸道微生物分子多態(tài)性及纖維素降解菌多樣性研究.pdf

1、從生態(tài)學(xué)和進(jìn)化角度來(lái)說(shuō)，腸道微生物對(duì)宿主昆蟲有著非常重要的作用。然而，腸道微生物種類和群落組成是否會(huì)隨著宿主昆蟲棲息地環(huán)境的變化而變化，目前鮮有報(bào)道，是值得深入研究的問(wèn)題。本文研究了不同地理種群暗黑鰓金龜幼蟲后腸腸道細(xì)菌群落組成和多樣性，以及環(huán)境因子對(duì)腸道細(xì)菌群落組成和多樣性的影響。同時(shí)，采用好氧培養(yǎng)技術(shù)，從暗黑鰓金龜幼蟲后腸內(nèi)分離了具有纖維素酶產(chǎn)生能力的菌株，并從中克隆了纖維素酶基因，研究了腸道細(xì)菌對(duì)蠐螬的生理功能方面的作用。

2、　　 1.構(gòu)建了10個(gè)不同地理種群暗黑鰓金龜幼蟲腸道細(xì)菌的16S rRNA基因克隆文庫(kù)，并通過(guò)變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)分析歸類克隆子，挑取不同DGGE斑型(band type)對(duì)應(yīng)的克隆子測(cè)序。結(jié)果表明幼蟲腸道細(xì)菌可歸為205個(gè)操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，分別屬于厚壁菌門(Firmicutes)，變

3、形菌門(Proteobacteria)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)。
　　 比較不同地理種群暗黑鰓金龜幼蟲腸道細(xì)菌群落及組成，可以發(fā)現(xiàn)以下幾個(gè)特征：
　　 (1)厚壁菌門和變形菌門細(xì)菌為腸道細(xì)菌優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群。厚壁菌門中的梭菌綱細(xì)菌廣泛存在于所有10個(gè)地理種群蠐螬腸道內(nèi)，且為腸道細(xì)菌絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。β-變形菌綱，γ-變形菌綱和ε-變形

4、菌綱的細(xì)菌也廣泛存在于10個(gè)地理種群樣本蠐螬腸道內(nèi)，只不過(guò)與梭菌綱細(xì)菌相比，所占比例較小。擬桿菌門，放線菌門和梭桿菌門細(xì)菌的分布則非常不均勻，在有些種群的蠐螬腸道內(nèi)有分布，有些種群腸道內(nèi)則沒有。
　　 (2)有6種OTUs代表的細(xì)菌遺傳型為所有地理種群的蠐螬所共有，在10個(gè)種群蠐螬腸道細(xì)菌克隆文庫(kù)內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。其余的細(xì)菌遺傳型在地理種群樣本腸道內(nèi)則呈不均勻分布：很多細(xì)菌遺傳型只存在特定的地理種群蠐螬腸道內(nèi)，在其他種群的蠐螬腸道內(nèi)沒

5、有分布。
　　 (3)不同種群蠐螬腸道細(xì)菌群落多樣性存在很大差異：天津種群腸道細(xì)菌種類數(shù)最少，為38.8，而福建種群腸道細(xì)菌豐富度最高，細(xì)菌種類數(shù)為86.5。∫-LIBSHUFF分析發(fā)現(xiàn)絕大部分種群腸道細(xì)菌克隆文庫(kù)組成之間存顯著性差異。
　　 (4)相關(guān)分析(Spearman nonparametric correlation test)和冗余分析(Redundancy discriminate analysis，RDA

6、)結(jié)果顯示，不同地理種群蠐螬腸道細(xì)菌群落組成和多樣性方面的差異，與宿主昆蟲棲息地環(huán)境條件密切相關(guān)。宿主昆蟲棲息的土壤理化條件(如土壤pH，土壤有機(jī)質(zhì)含量和土壤全氮量)，以及棲息地的氣候條件(年平均溫度，一月份最低溫和年降雨量)等環(huán)境因子，都可以顯著影響蠐螬腸道細(xì)菌多樣性和群落組成。
　　 2.從暗黑鰓金龜幼蟲后腸內(nèi)分離到207株纖維素降解菌。通過(guò)核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析(Amplifed Ribosomal DNA

7、Restriction Analysis，ARDRA)分型后，結(jié)合代表菌株16S rDNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，所有這些纖維素降解菌可以歸為21種不同的細(xì)菌，分布在4個(gè)不同的門：變形菌門，放線菌門，厚壁菌門和擬桿菌門，其中，變形菌門細(xì)菌為纖維素降解菌中最優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類群。假單胞菌屬Pseudomonas，纖維菌屬Cellulosimicrobium，蒼白桿菌屬Ochrobactrum，根瘤菌屬Rhizobium和微桿菌屬M(fèi)icr

8、obacterium為最主要的屬。而屬于芽孢桿菌屬Bacillus，發(fā)酵成對(duì)桿菌屬Dyadobacter，Siphonobacter屬，副球菌屬Paracoccus，Kaistia屬，德沃斯氏菌屬Devosia，Labrys屬，劍菌屬Ensifer，貪食菌屬Variovorax，Shinella屬，檸檬酸桿菌屬Citrobacter和寡養(yǎng)食單胞菌屬Stenotrophomonas的細(xì)菌也被分離得到，只不過(guò)所占比例較小。此外，在本研究中，

9、有一些種類的細(xì)菌，如Siphonobacter aquaeclarae，芬氏纖維微菌Cellulosimicrobium funkei，Paracoccus sulfuroxidans，弗氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii和硝化還原假單胞菌Pseudomonas nitroreducens都是首次被報(bào)道具有纖維素降解活性。
　　 3.本研究使用兼并引物同源克隆并結(jié)合染色體步移的方法，從1株暗黑鰓金龜腸道內(nèi)的纖維

10、素降解菌Rhizobium radiobacter基因組內(nèi)成功獲得2個(gè)纖維素酶編碼基因。其中1個(gè)基因?yàn)镚H3家族的纖維素酶基因(暫命名celⅢ)，Blast結(jié)果顯示，celⅢ與來(lái)自Grosmannia clavigera kw1407的beta-glucosidase的相似性為60%。另1個(gè)基因?qū)儆贕H8家族的纖維素酶基因(暫命名celⅧ)，而BlastⅩ結(jié)果顯示，celⅧ編碼的蛋白與來(lái)自Agrobacterium sp.ATCC317