Klotho對(duì)衰老間質(zhì)細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞CCL--2分泌的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)報(bào)道全球每年CRC新發(fā)病例高達(dá)136萬，死亡病例約達(dá)69萬，嚴(yán)重危害人類健康。尋找結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子及其相互關(guān)系，進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。
　　結(jié)直腸癌發(fā)病隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老可能影響周圍微環(huán)境促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。該微環(huán)境是由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤

2、周圍的細(xì)胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。
　　Klotho是由Kuro-o等在1997年發(fā)現(xiàn)的一種衰老相關(guān)多功能蛋白，其在生物整體抗衰老和延長(zhǎng)壽命方面的作用廣受關(guān)注。Klotho基因表達(dá)下降與壽命縮短、動(dòng)脈硬化、心腦血管等疾病的發(fā)生相關(guān)。近年來人們發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤組織中也存在Klotho低表達(dá)現(xiàn)象，提示Klotho基因可能參與腫瘤調(diào)控。我們前期利用基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn)Klotho基因受到表觀遺傳調(diào)控，在結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)與啟動(dòng)子DNA高

3、甲基化有關(guān)。本研究將進(jìn)一步闡明Klotho在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的臨床價(jià)值和重要生物學(xué)功能，探討Klotho對(duì)間質(zhì)細(xì)胞衰老和衰老相關(guān)分泌表型的表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　1、Klotho在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及意義:
　　通過收集143例結(jié)直腸癌患者的組織標(biāo)本，分析Klotho在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平差異及其與患者臨床病理參數(shù)和生存預(yù)后之間的相關(guān)性，明確Klotho在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的臨

4、床意義。
　　2、Klotho對(duì)細(xì)胞衰老和結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:
　　應(yīng)用重組Klotho蛋白處理不同間質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞），檢測(cè)SA-β-gal染色及衰老標(biāo)志分子，觀察Klotho對(duì)細(xì)胞衰老的影響。通過系列體內(nèi)外試驗(yàn)，利用Klotho預(yù)處理不同間質(zhì)細(xì)胞后，收集條件培養(yǎng)基與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng);或在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)Klotho，探討Klotho對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及其裸鼠成瘤能力的影響。
　　

5、3、Klotho對(duì)衰老相關(guān)分泌表型CCL-2表達(dá)的影響與生物學(xué)作用:
　　通過建立批量衰老相關(guān)分泌表型分子篩選和驗(yàn)證。利用細(xì)胞體外和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索關(guān)鍵衰老相關(guān)分泌表型因子CCL-2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　4、Klotho通過NF-κB信號(hào)通路抑制CCL-2分泌:
　　在間質(zhì)細(xì)胞中，應(yīng)用重組Klotho蛋白或NF-κB特異性拮抗劑處理，或在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)Klotho，通過免疫印跡法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路

6、中相關(guān)分子的表達(dá)變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)CCL-2的分泌情況，探討Klotho對(duì)NF-κB和CCL-2的調(diào)控機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　　1、Klotho在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)并與患者預(yù)后差相關(guān)
　　免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，較癌旁配對(duì)非腫瘤組織，Klotho在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯降低，其表達(dá)水平與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)（n=143，P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組

7、織中Klotho高表達(dá)的患者預(yù)后較好。多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)Klotho高表達(dá)是患者生存時(shí)間長(zhǎng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（P＜0.05）。
　　2、Klotho抑制間質(zhì)細(xì)胞衰老和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
　　(1)Klotho對(duì)間質(zhì)細(xì)胞衰老的影響。SA-β-gal染色及衰老標(biāo)志分子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人重組Klotho蛋白預(yù)處理間質(zhì)細(xì)胞，可以減少細(xì)胞衰老。
　　(2)Klotho通過抑制間質(zhì)細(xì)胞衰老對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　

8、　①CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)過衰老細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，其生長(zhǎng)速度明顯加快，而外源Klotho預(yù)處理則明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　②Transwell試驗(yàn)表明結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)過衰老細(xì)胞的條件培養(yǎng)基趨化后，其遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，而外源Klotho預(yù)處理可減弱結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。
　?、劢Y(jié)腸癌皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞與衰老細(xì)胞混合注射組裸鼠腫瘤體積和重量明顯大于年輕細(xì)胞組，而Klot

9、ho預(yù)處理組裸鼠腫瘤的體積和重量最小。
　　(3)過表達(dá)Klotho抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
　?、貱CK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Klotho顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。
　　②Transwell試驗(yàn)表明過表達(dá)Klotho能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。
　?、劢Y(jié)腸癌皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Klotho后裸鼠瘤體的生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯減慢。
　　3、Klotho可抑制SASP分子CCL-2的表

10、達(dá)及其促結(jié)腸癌生長(zhǎng)、遷移、侵襲作用
　　(1)間質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)衰老后，CCL-2的mRNA表達(dá)和蛋白的分泌明顯升高，而Klotho蛋白的預(yù)處理則顯著下調(diào)CCL-2。
　　(2)CCL-2具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移作用
　?、貱CK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCL-2蛋白共培養(yǎng)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，特異性受體CCR2拮抗劑可阻斷該作用。
　?、赥ranswell試驗(yàn)表明CCL-2顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力，而特異性受體C

11、CR2拮抗劑可阻斷該作用。
　?、劢Y(jié)腸癌皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)瘤周注射CCL-2分子后裸鼠瘤體的生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯增快，而同時(shí)注射CCR2特異性拮抗劑后可抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　4、Klotho通過NF-κB信號(hào)通路抑制CCL-2分泌
　　(1)衰老成纖維細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路活化，人重組Klotho蛋白和NF-κB特異性拮抗劑可以抑制其活化。
　　(2)熒光定量PCR和ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NF-κB特異性拮抗劑或Kl

12、otho處理后，細(xì)胞CCL-2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。
　　(3)在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)Klotho后NF-κB信號(hào)通路被抑制，CCL-2的mRNA表達(dá)及蛋白分泌明顯減少。
　　研究結(jié)論：
　　1、在結(jié)直腸癌組織中Klotho普遍低表達(dá)，其表達(dá)水平與患者的年齡，腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期和患者的生存預(yù)后相關(guān)。Klotho高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后良好的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。
　　2、Klotho可