RNA干擾沉默Cx43基因表達抑制血管再狹窄的研究.pdf

1、研究背景：
　　 經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous transluminal coronary intervention，PCI)是目前冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要治療措施之一，然而，PCI術(shù)后血管再狹窄(restenosis，RS)高發(fā)生率嚴重影響了其治療效果。因此，闡明血管RS發(fā)生機制，并尋找有效治療方法成為心血管藥理研究領(lǐng)域一大難點與熱點。縫隙連接(gap junction，GJ)是相鄰細胞間無機離子、小

2、分子物質(zhì)(<1kDa)和細胞代謝產(chǎn)物交換的直接通道。研究表明，血管壁存在廣泛的縫隙連接網(wǎng)絡(luò)，能感受腔內(nèi)外刺激并作出整體反應(yīng)，血管病變時縫隙連接蛋白(connexins，Cxs)發(fā)生了重構(gòu)。我們假設(shè)Cx43重構(gòu)可能參與血管RS的病理過程，沉默Cx43基因表達可能對血管RS具有抑制作用，進而為血管RS的防治提供新的理論和靶點。
　　 目的：
　　 闡明Cx43重構(gòu)與血管RS的相關(guān)性，通過RNA干擾(ribonucleic a

3、cidinterfering，RNAi)技術(shù)沉默Cx43基因，在整體模型上觀察其對血管RS的抑制作用。為開發(fā)新型載基因支架治療RS的臨床前研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 將24只SD大鼠隨機分為四組(n=6)：假手術(shù)組、模型組、Cx43一RNAi-LV治療組和NC-GFP-LV組。除假手術(shù)組外，其他三組左頸總動脈均行球囊內(nèi)膜損傷術(shù)，術(shù)后分別注入100μL生理鹽水、Cx43-RNAi-LV和NC-GFP-LV至頸總

4、動脈并在37℃下孵育1h，慢病毒滴度為5×108TU/mL。術(shù)后28d大鼠均處死，取左側(cè)頸總動脈備用，熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒感染效率；HE染色測定血管形態(tài)；免疫組化觀察Cx43蛋白陽性表達及分布；Western Blotting檢測Cx43蛋白表達量。
　　 結(jié)果：
　　 熒光倒置顯微鏡觀察顯示：假手術(shù)組和模型組均未發(fā)現(xiàn)熒光，Cx43-RNAi-LV治療組和NC-GFP-LV組新內(nèi)膜及中膜觀察到大量熒光，表明慢病毒成功

5、感染頸總動脈。
　　 HE染色結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，術(shù)后28d模型組和NC-GFP-LV組新內(nèi)膜明顯增厚，新內(nèi)膜面積/中膜面積(neointima area/media area，NA/MA)顯著增加(p<0.01)，表明成功建立血管RS模型。與模型組相比，Cx43-RNAi-LV治療組新內(nèi)膜增生明顯減輕，NA/MA值顯著降低(P<0.05)，提示Cx43-RNAi-LV對血管RS具有顯著抑制作用。
　　 免疫組化觀

6、察顯示：四組大鼠血管中膜平滑肌細胞均有Cx43陽性表達。與假手術(shù)組比較，術(shù)后28d模型組和NC-GFP-LV組新內(nèi)膜明顯增厚，Cx43蛋白陽性表達密度增加。與模型組相比，Cx43-RNAi-LV治療組Cx43蛋白陽性表達密度明顯降低，提示Cx43重構(gòu)參與了血管RS病理過程。
　　 Western Blotting檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，術(shù)后28d模型組和NC-GFP-LV組Cx43蛋白表達量顯著增加(P<0.01)。與模型