通過聯(lián)合的隨機和定點飽和突變改善Thermobifida fusca海藻糖合成酶的特性.pdf

1、具有較高酶活性和熱穩(wěn)定性的海藻糖合成酶在酶法生產海藻糖中很重要。我們用實驗室進化方法獲得了酶活力和熱穩(wěn)定性有所提高的突變酶。運用隨機突變和定點飽和突變相聯(lián)合的策略來產生突變庫。經過一輪的隨機突變，篩選到一個酶活力提高了80％且Km值下降(由15mmol/L下降為7.45mmol/L)的突變體。經測序表明該突變體J37在氨基酸序列266和325位發(fā)生了氨基酸替換，為D266G/Q325R。 為了獲得更好的優(yōu)化酶，我采用了半理性設

2、計。以寡基1，6-葡萄糖苷酶的晶體結構為模板，在網站SWISS-MODEL同源模建褐色喜熱裂孢菌海藻糖合成酶的三維結構。結合分析TreS-fu與四種來自不同微生物的功能已鑒定的海藻糖合成酶的比對結果，選定TreS-fu的Phe227、Asp230、His341、Asp342和Glu409的氨基酸殘基為待突變位點。通過不同的快速PCR介導定點突變的方法，將這5個位點的氨基酸分別進行定點飽和突變，獲得了A74(F227C/D266G/Q32

3、5R)、E56(D266G/Q325R/D342E)、C14(D230V)、E99(H341N)、F12(E409X)等5個突變體，其中F12(E409X)突變子均比野生型酶的活力低；突變體A74、C14、E56和E99的酶活力比野生型酶有不同程度的提高。被三個氨基酸取代的突變體A74的比活力是野生型酶的2.6倍，對其動力學分析表明，突變子A74的酶活力最適溫度提高了5℃，半衰期為野生型的2.67倍，Tm值提高了3℃，其催化效率Kcat