HSP27在糖尿病膀胱功能障礙中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本項(xiàng)目擬選ZDF大鼠作為DM大鼠模型，并利用HSP27特異性磷酸化抗體，檢測DBD逼尿肌HSP27表達(dá)及磷酸化水平的改變;以及調(diào)節(jié)HSP27磷酸化后離體逼尿肌條收縮相關(guān)功能的變化，初步驗(yàn)證HSP27對DBD后逼尿肌收縮功能的影響;為了明確HSP27的表達(dá)及磷酸化與CaD、TM等相關(guān)收縮蛋白之間的相互作用在DBD的關(guān)系，通過調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)逼尿肌細(xì)胞中HSP27的磷酸化水平改變（基因轉(zhuǎn)染）后檢測HSP27與CaD、TM的共表達(dá)變化;激光共聚焦

2、檢測磷酸化HSP27與CaD等收縮相關(guān)蛋白的相互定位關(guān)系，探討其在穩(wěn)定肌動蛋白結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)平滑肌收縮中的作用機(jī)制。
　　研究一 調(diào)節(jié)HSP27磷酸化改變糖尿病大鼠的膀胱收縮功能的研究
　　目的：
　　研究正常大鼠與ZDF(zucker diabetic fatty)糖尿病大鼠膀胱收縮功能的差異，超微結(jié)構(gòu)差異。
　　方法：
　　將2月齡ZDF雄性大鼠DM組(n=20)高糖高脂飼養(yǎng)，將2月齡SD雄性大鼠對照組(n

3、=20)正常飲食條件下飼養(yǎng)，16周后檢測大鼠的空腹血糖，行尿動力學(xué)檢測（膀胱殘余尿量、最大膀胱容量、最大膀胱壓力）;透射電鏡檢測DM組與對照組膀胱逼尿肌組織超微結(jié)構(gòu)改變情況;用HSP27磷酸化p38MAPK途徑的特異性抑制劑和激動劑SB203580(C21H16FN3OS)和Anisomysin(ab120495C14H19NO4)預(yù)處理肌條，分別檢測HSP27去磷酸化或過磷酸化對肌條收縮力和收縮頻率的影響。
　　結(jié)果：
　

4、　DM組膀胱收縮功能和逼尿肌牽張力低于SD組大鼠，糖尿病大鼠膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯退行性變化。DM組牽張力顯著低于SD組;HSP27磷酸化途徑特異性的抑制劑SB203580刺激肌條后DM組及SD組肌條牽張力降低;HSP27磷酸化途徑特異性的激動劑Anisomysin刺激后DM組及SD組肌條收縮力升高。SD組抑制后牽張力與未經(jīng)處理DM組無顯著差異;DM組抑制后與未經(jīng)處理DM組無顯著差異;DM組激動后牽張力與未經(jīng)處理SD組無顯著差異。<

5、br>　　結(jié)論：
　　1.DBD膀胱收縮力顯著降低ZDF糖尿病雄性大鼠是理想的2型糖尿病研究動物模型，血糖明顯高于正常大鼠，膀胱逼尿肌最大排尿壓力顯著低于正常大鼠。
　　2.DBD膀胱結(jié)構(gòu)退化用電子顯微鏡檢測逼尿肌超微結(jié)構(gòu)與對照相比，糖尿病組ZDF大鼠的逼尿肌細(xì)胞肥厚、腫脹，細(xì)胞內(nèi)肌絲減少和萎縮。
　　3.DBD的逼尿肌牽張力明顯低于正常組，趨勢與膀胱排尿壓一致。
　　4.DBD中HSP27磷酸化起重要的調(diào)節(jié)作用

6、：針對正常組，下調(diào)其HSP27的磷酸化水平，牽張力可降低到與糖尿病組相近;針對糖尿病組，上調(diào)其HSP27的磷酸化水平，牽張力可接近正常組;而下調(diào)其HSP27的磷酸化水平，牽張力無更明顯降低。
　　研究二 高糖對大鼠逼尿肌組織及細(xì)胞的HSP27及磷酸化水平CaD、TM的表達(dá)影響及機(jī)制研究
　　目的:
　　研究糖尿病膀胱組織HSP27及其磷酸化位點(diǎn)Ser15、Ser78、Ser82以及CaD、TM的表達(dá)差異;不同濃度葡萄糖

7、是否對逼尿肌細(xì)胞HSP27及磷酸化水平表達(dá)和相關(guān)收縮蛋白CaD、TM的表達(dá)有影響;3 D-HSP27和3G-HSP27經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染逼尿肌細(xì)胞后是否對HSP27及相關(guān)收縮蛋白CaD、TM的表達(dá)有影響。
　　方法:
　　利用免疫熒光染色，組織學(xué)檢測DM組與對照組膀胱HSP27和CaD、TM的表達(dá)與分布情況;用QRT-PCR和Western-blot的方法檢測DM膀胱及對照組膀胱中HSP27的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平差異。利用特異性的磷酸化

8、抗體標(biāo)記檢測HSP27 Ser15、Ser78和Ser82的磷酸化水平變化。 用QRT-PCR和Western-blot的方法檢測DM膀胱及對照組膀胱中CaD、TM等相關(guān)收縮蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平差異。SD大鼠斷頸處死，超凈工作臺內(nèi)開腹，取出膀胱，去黏膜層并剪碎后移入10ml 0.1％膠原酶P消化液的離心管中，37。C孵育45min到1h，漂洗后細(xì)胞懸液重懸于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中;培養(yǎng)基中正常葡萄糖濃度(5mM)為對照組，高葡

9、萄糖濃度(50mM)為干預(yù)組，通過免疫熒光染色和westernblot檢測48h后HSP27在逼尿肌細(xì)胞表達(dá)和磷酸化水平，通過QRT-PCR和Western-blot的方法檢測逼尿肌細(xì)胞中CaD、TM的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平差異。構(gòu)建、純化LV5-3 G-HSP27和LV5-3D-HSP27過表達(dá)慢病毒包裝，通過LV5-3G-HSP27 homo、LV5-3D-HSP27 homo及LV5 NC陰性對照病慢毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染逼尿肌細(xì)胞。細(xì)胞在靜息狀

10、態(tài)或0.1uM乙酰膽堿刺激后，收集體外培養(yǎng)的逼尿肌細(xì)胞裂解后提取細(xì)胞蛋白，然后通過免疫共沉淀和免疫印跡技術(shù)分析磷酸化的HSP27與收縮相關(guān)蛋白(CaD、TM)的結(jié)合能力。將pEYFP-HSP27分別和pECFP-CaD、pECFP-TM的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染膀胱逼尿肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，激光共聚焦顯微鏡檢測蛋白共定位情況。
　　結(jié)果:
　　膀胱組織中HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表達(dá)下降，并且其三個磷酸化亞型(Ser15、Ser78

11、和Ser82)均顯著低于正常對照組;而CaD和TM顯著高于正常對照組;高糖培養(yǎng)組的SD大鼠逼尿肌細(xì)胞數(shù)明顯低于正常糖濃度。
　　逼尿肌細(xì)胞培養(yǎng)中，QRT-PCR檢測高糖培養(yǎng)組CaD和TM在逼尿肌細(xì)胞的表達(dá)高于正常糖濃度組;免疫熒光檢測HSP27在高糖培養(yǎng)組中表達(dá)下降，并且其三個磷酸化亞型（Ser15、Ser78和Ser82）均顯著低于正常對照組;Western blot檢測高糖組下HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表達(dá)下降，并且其三

12、個磷酸化亞型（Ser15、Ser78和Ser82）均顯著低于正常對照組，而CaD和TM顯著高于正常對照組。
　　LV5-3D-HSP27過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的膀胱平滑肌細(xì)胞，HSP27與CaD共沉淀增加，LV5-3G-HSP27過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的膀胱平滑肌細(xì)胞，HSP27與CaD共沉淀減少，HSP27和TM共沉淀呈陰性;激光共聚焦下pEYFP-HSP27和pECFP-CaD共轉(zhuǎn)染組HSP27的分布與CaD分布共定位非常

13、接近，pEYFP-HSP27和pECFP-TM共轉(zhuǎn)染組HSP27的分布與TM分布無明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　1.HSP27及其磷酸化水平在糖尿病膀胱組織和體外高糖培養(yǎng)的逼尿肌細(xì)胞中表達(dá)、分布和轉(zhuǎn)錄水平降低，而CaD和TM平滑肌收縮相關(guān)蛋白表達(dá)和分布增高;其中HSP27磷酸化水平的下調(diào)使逼尿肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定性，是糖尿病膀胱收縮功能降低的主要原因之一。
　　2.膀胱逼尿肌收縮機(jī)制之一可能為:磷酸化的HSP27增加了C

14、aD與其的結(jié)合，并使之發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，釋放出TM，結(jié)合肌動蛋白產(chǎn)生收縮;而糖尿病狀態(tài)下，低磷酸化水平的HSP27結(jié)合CaD能力降低，CaD與TM更多的綁定在一起，而TM無法與肌動蛋白結(jié)合，使收縮力下降。
　　綜上所述，我們在組織層面利用2型糖尿病ZDF雄性大鼠模型完成膀胱壓力測試及對超微結(jié)構(gòu)的觀察，并揭示高糖中HSP27磷酸化表達(dá)下降使逼尿肌的收縮結(jié)構(gòu)和收縮功能活性下調(diào)可能是DBD的發(fā)病機(jī)制。其中收縮力的下調(diào)可以通過HSP27磷酸化

15、的抑制劑或激動劑所改變。
　　2型大鼠模型中將DBD與HSP27的磷酸化及相關(guān)收縮蛋白對平滑肌收縮功能的調(diào)節(jié)聯(lián)系起來，來探尋DBD肌源性改變的趨勢及其機(jī)制。
　　在細(xì)胞層面研究高糖對大鼠膀胱逼尿肌相關(guān)收縮蛋白及磷酸化轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響。并揭示高糖下調(diào)了HSP27及其磷酸化水平，而上調(diào)了CaD和TM的表達(dá)。在通過過磷酸化的HSP27經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染逼尿肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)HSP27磷酸化激活了CaD的磷酸化并與之結(jié)合，使被CaD綁定的TM釋放

16、而促進(jìn)收縮的發(fā)生，從而解釋了糖尿病的氧化應(yīng)激從上游下調(diào)了HSP27磷酸化而上調(diào)了CaD，而CaD的活性也需要在磷酸化的HSP27激活下與HSP27結(jié)合發(fā)生結(jié)構(gòu)變異才能釋放TM，使肌肉收縮。故可以作出以下推測:①糖尿病導(dǎo)致HSP27和磷酸化的HSP27減少，這種下調(diào)導(dǎo)致CaD更多的與TM綁定而收縮功能下降;糖尿病導(dǎo)致氧化應(yīng)激誘導(dǎo)了更多的CaD，而上調(diào)的CaD因?yàn)槿狈α姿峄疕SP27的激活失去活性，導(dǎo)致其也綁定了更多的TM;這是DBD中HS

17、P27參與調(diào)節(jié)的收縮功能降低的主要機(jī)制;②可能TM活性也需要磷酸化HSP27來激活，糖尿病誘導(dǎo)TM表達(dá)增多同時因?yàn)榻档偷牧姿峄疕SP27而減少了激活，也導(dǎo)致DBD中TM不能結(jié)合肌動蛋白實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)收縮的活性。綜上，糖尿病狀態(tài)下，因?yàn)楦哐堑挠绊?，HSP27、磷酸化HSP27以及逼尿肌細(xì)肌絲收縮相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變并均處于低活性狀態(tài)，這使作用相當(dāng)于骨骼肌中肌鈣蛋白的這組平滑肌肌絲運(yùn)動相關(guān)蛋白對收縮的開關(guān)調(diào)節(jié)功能難以保持在正常水平上。該推測揭示