Tmub1對大鼠肝再生過程中肝細(xì)胞增殖及securin泛素化的影響.pdf

1、肝功能衰竭是各種肝臟疾病的終末期狀態(tài)，死亡率極高，是目前肝臟疾病治療的難點。近年來人工肝、組織工程等技術(shù)有了較大的突破，但這些技術(shù)仍有較大的局限性，生物人工肝的臨床療效有限，而組織工程技術(shù)又短時難以應(yīng)用于臨床。目前肝臟移植是治療肝衰竭的唯一有效手段，但由于存在供體短缺、價格昂貴、免疫排斥等不足，難以廣泛開展。由于肝臟具有極強再生能力，在受到各種理化損傷后能通過自身的再生修復(fù)受損的肝臟組織和細(xì)胞，因此有效刺激肝臟自身的合理再生被認(rèn)為是治療

2、肝臟功能衰竭的理想手段。對于肝臟外科而言，肝切除術(shù)(partial hepatectomy，PH)被廣泛應(yīng)用于各種肝臟外科良惡性疾病的治療，而過多地切除肝臟組織也易導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭。在肝切除術(shù)后，成熟肝細(xì)胞可以在一系列精密調(diào)控的情況下，通過增生和增殖進(jìn)行肝再生。如果能夠增強肝臟本身的再生能力，并給予適當(dāng)?shù)募s束和調(diào)控，將對肝功能衰竭的防治提供巨大的幫助，為肝臟外科醫(yī)生開展更大范圍的肝切除提供有力的支持。因此，研究肝切除術(shù)后的肝臟再生調(diào)控

3、網(wǎng)絡(luò)對于理解肝再生過程、防治肝衰竭具有非常重要的意義。
　　Tmub1（transmembrane and ubiquitin like domain containing1）是一個包含泛素樣結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的核質(zhì)穿梭蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，在肝再生過程中，Tmub1迅速出核并高表達(dá)，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控肝細(xì)胞增殖的作用，但目前對于Tmub1負(fù)向調(diào)控肝再生的機制仍缺乏了解。課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn)，securin可能是Tmub1的下游靶蛋白之一。

4、Securin即分離酶抑制蛋白，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。在有絲分裂結(jié)束之前securin必須經(jīng)過泛素化-蛋白酶體途徑降解，才能使細(xì)胞順利完成姐妹染色單體的分離。有研究表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白降解通路(endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)中，Tmub1可以與gp78和SPFH2形成復(fù)合體，介導(dǎo)HMG-CoA還原酶的泛素化，因此，Tmub1有可能通過參與securin

5、的泛素化降解過程來影響肝細(xì)胞的增殖。但是，Tmub1參與泛素化的現(xiàn)象和機制仍報道極少，而且目前人們對泛素樣蛋白的功能還沒有統(tǒng)一的認(rèn)識，該類蛋白也可能通過非泛素化途徑發(fā)揮作用。因此，具體的作用機制需深入研究，Tmub1的泛素樣結(jié)構(gòu)域(UBL)是否能直接或間接地參與泛素化調(diào)控也需要進(jìn)一步明確。
　　目的：
　　1.利用大鼠70％肝切除模型，明確Tmub1和securin的mRNA和蛋白水平在肝再生全程中的表達(dá)規(guī)律及相關(guān)性。

6、>　　2.進(jìn)一步明確Tmub1對大鼠正常肝細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期和有絲分裂的影響。
　　3.明確Tmub1對securin泛素化調(diào)控過程的影響，并初步探索Tmub1的泛素樣結(jié)構(gòu)域(UBL)在securin泛素化過程中的作用。
　　材料和方法：
　　1.通過構(gòu)建大鼠70％肝切除再生模型，采用RT-qPCR和Western Blotting技術(shù)檢測Tmub1和securin在肝再生過程中的表達(dá)規(guī)律。
　　2.分別構(gòu)建

7、Tmub1過表達(dá)和shRNA干擾的慢病毒載體，分別感染大鼠正常肝細(xì)胞系BRL-3A并建立穩(wěn)定感染細(xì)胞株，通過CCK-8、EdU、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測Tmub1表達(dá)對BRL-3A細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的影響。
　　3.采用細(xì)胞周期同步化和免疫熒光技術(shù)，觀察Tmub1過表達(dá)對BRL-3A細(xì)胞有絲分裂過程的影響，并使用Western Blotting檢測有絲分裂進(jìn)程中cyclins（細(xì)胞周期素蛋白）的表達(dá)量。
　　4.使用免疫沉淀

8、、Western Blotting、RT-qPCR檢測Tmub1表達(dá)對securin的表達(dá)及其泛素化水平的影響。
　　5.構(gòu)建Tmub1的UBL結(jié)構(gòu)域突變體和截斷體質(zhì)粒載體，檢測UBL結(jié)構(gòu)域突變或缺失后的Tmub1對securin泛素化水平的影響。
　　6.實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，使用GraphPad Prism6.0軟件繪制統(tǒng)計圖;計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗進(jìn)行兩組間均數(shù)比較，單因素

9、方差分析與LSD法進(jìn)行多組間均數(shù)比較。P＜0.05作為顯著統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.Tmub1的mRNA和蛋白水平在大鼠70％肝切除術(shù)后均先升高，在術(shù)后24～48h達(dá)到高峰后降低;securin的mRNA和蛋白表達(dá)趨勢不一致，其mRNA水平在手術(shù)12h后逐漸增加，在術(shù)后48h達(dá)到高峰后逐漸降低，而其蛋白水平在術(shù)后逐漸降低，術(shù)后48h最低，至術(shù)后7d恢復(fù)較高水平;Tmub1表達(dá)水平和securin mRNA水平在

10、時間上呈正向相關(guān)，和securin蛋白水平在時間上呈負(fù)向相關(guān)。
　　2.增強Tmub1表達(dá)可使BRL-3A細(xì)胞增殖能力降低，而抑制Tmub1表達(dá)則導(dǎo)致BRL-3A細(xì)胞增殖能力增強。Tmub1過表達(dá)可顯著增加G1期的細(xì)胞比例，降低S及G2/M期的細(xì)胞比例，而抑制Tmub1表達(dá)則可顯著增加S期細(xì)胞比例，降低G1期細(xì)胞比例。
　　3.Tmub1過表達(dá)可影響B(tài)RL-3A細(xì)胞有絲分裂期進(jìn)程，并影響cyclins在M期的表達(dá)水平。其中，

11、在陰性對照組BRL-3A細(xì)胞中，cyclinA和cyclin B1的表達(dá)量在有絲分裂第0.5h時即明顯降低，而在Tmub1過表達(dá)組中，cyclinA和cyclin B1的表達(dá)在1.5h時都仍維持較高水平。
　　4.過表達(dá)或干擾Tmub1對securin基因轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響，但可影響其蛋白表達(dá)水平:過表達(dá)Tmub1可明顯增加securin蛋白表達(dá)，干擾Tmub1可明顯降低securin蛋白表達(dá)。
　　5.Tmub1過表達(dá)可下

12、調(diào)securin的泛素化水平，抑制Tmub1表達(dá)可增加securin的泛素化水平。
　　6.Tmub1的UBL結(jié)構(gòu)域突變體和截斷體均不能引起securin泛素化水平的改變。BRL-3A細(xì)胞轉(zhuǎn)染UBL結(jié)構(gòu)域突變體質(zhì)粒后，securin泛素化水平與陰性對照組無明顯差異;轉(zhuǎn)染UBL結(jié)構(gòu)域截斷體質(zhì)粒后，securin泛素化水平與陰性對照組也無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　Tmub1在肝再生過程中的表達(dá)具有明顯的規(guī)律性，可抑制肝細(xì)