半滑舌鰨免疫相關(guān)基因C8和SHP-1的克隆、重組表達(dá)和功能分析.pdf

1、魚類養(yǎng)殖在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有舉足輕重的地位，但日益頻發(fā)的病害問(wèn)題嚴(yán)重制約了魚類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前產(chǎn)業(yè)上迫切需要有效的病害防治技術(shù)保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。對(duì)魚類免疫機(jī)理的深入研究是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的根本途徑。半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類，目前養(yǎng)殖產(chǎn)值達(dá)到10億元之多，但是細(xì)菌性和病毒性病害對(duì)半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅，由于對(duì)半滑舌鰨抗菌和抗病毒免疫防御機(jī)理不清楚，缺乏有效病害防治措施。通

2、過(guò)半滑舌鰨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中抗病組、染病組和健康組的CsC8基因和CsSHP-1的表達(dá)量存在顯著差異，而且鑒于此CsC8基因和CsSHP-1在半滑舌鰨免疫系統(tǒng)中的重要性，本研究以半滑舌鰨為研究對(duì)象，對(duì)CsC8基因和CsSHP-1基因進(jìn)行克隆鑒定、重組表達(dá)及功能分析，闡明半滑舌鰨抗病分子機(jī)制，為半滑舌鰨的病害防治提供重要理論基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　對(duì)半滑舌鰨CsC8基因進(jìn)行了克隆和驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨補(bǔ)體CsC8由CsC8α、Cs

3、C8β和CsC8γ3條鏈組成，分別由CsC8α、CsC8β和CsC8γ編碼，其中CsC8α基因包含了1797 bp的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼598個(gè)氨基酸，CsC8β基因包含了1749 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼582個(gè)氨基酸，CsC8γ基因包含了666 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼221個(gè)氨基酸。將CsC8α、CsC8β和CsC8γ的基因比對(duì)半滑舌鰨基因組，發(fā)現(xiàn)CsC8α和CsC8β位于20號(hào)染色體上，而

4、CsC8γ位于第3號(hào)染色體上，并不是線性分布的。CsC8α、CsC8β和CsC8γ在13種健康組織中的表達(dá)情況顯示，CsC-8α、CsC8β和CsC8γ在不同組織中均有表達(dá)，其中肝臟中表達(dá)量最高，其次是脾臟和卵巢；感染鰻弧菌后，CsC8α基因在6種免疫組織中整體均表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，不同組織對(duì)鰻弧菌的敏感度不同，CsC8α基因在不同組織的表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)也不同，其中肝臟（48h）、血液（48h）、脾臟（12h）、腸（12h）、頭腎

5、（24h）和鰓（6h），而且CsC8α在血液中表達(dá)量變化最明顯，48h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到0h的119.3倍（P＜0.01）；CsC8β基因在6種免疫組織中整體表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，CsC8β基因在肝臟、脾臟和鰓中都是在24h出現(xiàn)表達(dá)的最高，在腸中是在6h出現(xiàn)表達(dá)的最大值，表現(xiàn)出組織敏感性，在血液中出現(xiàn)了反常，在6h和24h表達(dá)上調(diào)后開(kāi)始下調(diào)，但在72h出現(xiàn)表達(dá)的峰值，在頭腎中，12h和48h表達(dá)量達(dá)到峰值，而且CsC8β在頭腎中表達(dá)量變化最為

6、明顯，12h的表達(dá)量為0h的17.8倍（P＜0.01）；CsC8γ基因在6種免疫組織中整體表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，CsC8γ基因在肝臟、頭腎、脾臟、腸和鰓中都是在12h出現(xiàn)表達(dá)的最高峰，在血液中，CsC8γ的表達(dá)量變化最為明顯，72h的表達(dá)量為0h的48.3倍（P＜0.01）。重組蛋白CsC8α體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白CsC8α對(duì)鰻弧菌的抑制效果最為明顯，抑菌率隨著重組蛋白濃度的增加明顯升高；對(duì)愛(ài)德華氏菌和副溶血弧菌的抑菌效果明顯弱于

7、對(duì)鰻弧菌的抑菌效果，但也表現(xiàn)出了一定的抑菌作用；當(dāng)重組蛋白濃度超過(guò)0.3mg/ml后，也只達(dá)到0.5以上；對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌的代表菌株金黃色葡萄球菌，重組蛋白對(duì)其抑菌效果不明顯，抑菌率一直在0.5以下，在最高濃度0.5mg/ml時(shí)抑菌率才達(dá)到0.43，得不到明顯的抑菌效果。上述結(jié)果表明，半滑舌鰨補(bǔ)體基因C8在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，尤其是對(duì)細(xì)菌性病原菌引起的免疫反應(yīng)和對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用。
　　通過(guò)RACE和PCR技術(shù)獲得半

8、滑舌鰨CsSHP-1基因的cDNA全長(zhǎng)，CsSHP-1的cDNA全長(zhǎng)2045bp，編碼區(qū)共包含1743bp，控制編碼580個(gè)氨基酸。SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析得知CsSHP-1基因共包含2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，1個(gè)PTPc結(jié)構(gòu)域；通過(guò)氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果顯示，半滑舌鰨SHP-1與尼羅羅非魚Oreochromis niloticus的相似度最高，達(dá)到82％；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示魚類的SHP-1首先聚為一支然后再與高等脊椎動(dòng)物聚在一起。CsSHP-1基因

9、在13種健康組織中的表達(dá)分析顯示，半滑舌鰨CsSHP-1在各個(gè)組織中均有表達(dá)，在脾臟中的表達(dá)量最高，心臟中的表達(dá)最低；感染鰻弧菌后在6種免疫組織肝、脾、小腸、頭腎、鰓、血液中均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)，但是峰值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)不同；用4種病原模擬物處理半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞后，除PolyI：C處理后表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)趨勢(shì)外，其他實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但不是很明顯。為了進(jìn)一步探究CsSHP-1的功能，本研究在畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出分子

10、量為67kDa的重組CsSHP-1，用CCK-8法測(cè)試重組蛋白CsSHP-1對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231三種癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性及強(qiáng)度。結(jié)果顯示：重組蛋白CsSHP-1對(duì)3種癌細(xì)胞均有不同程度的細(xì)胞毒活性，其細(xì)胞毒活性強(qiáng)度順序?yàn)椋喝烁伟┘?xì)胞HepG2>人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231>人肺癌細(xì)胞A549。
　　綜上所述：半滑舌鰨免疫相關(guān)基因C8和SHP-1在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著作用，對(duì)