小檗堿通過SIRT1途徑抑制巨噬細胞炎癥反應的機制研究.pdf

1、胰島素靶組織的慢性炎癥是引起胰島素敏感性下降的主要病因，巨噬細胞是引發(fā)這種慢性炎癥狀態(tài)的主要細胞類型。黃連是臨床常用的治療2型糖尿病的中藥，其有效成分小檗堿已被證實具有改善巨噬細胞炎癥反應的作用，其作用機制尚不十分明確。SIRT1是一種去乙酰化酶，可以延長壽命，調控細胞凋亡，改善糖脂代謝和炎癥反應。由于小檗堿的抗炎特性與SIRT1的作用靶點和生物學效應基本一致，因此深入研究兩者的關系有助于為小檗堿多種藥理效應的機制研究提供線索，也對中醫(yī)

2、藥治療2型糖尿病提供新的思路。
　　目的:
　　運用體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞，觀察小檗堿對巨噬細胞炎癥因子和SIRT1表達的影響及SIRT1對小檗堿抗炎作用的影響，初步探討小檗堿的抗炎作用機制。
　　方法:
　　1) MTT法檢測小檗堿不同濃度(1、5、10、50、100umol/L)對RAW264.7巨噬細胞的細胞毒性;2）分別給予不同濃度(1、5umol/L)的小檗堿預處理RAW264.7巨噬細胞24

3、小時后，棄去藥物維持液，更換為含有100ng/ml的LPS藥物維持液的培養(yǎng)液，采用熒光定量PCR法檢測巨噬細胞TNF-α、IL-6、MCP-1的基因表達;3）將RAW264.7巨噬細胞分為四組:對照組，BBR組，LPS組和BBR+LPS組，小檗堿濃度為5umol/L，預處理24小時后，棄去藥物維持液，更換培養(yǎng)液，LPS作用濃度為100ng/ml，6小時后提取RNA和蛋白樣本，采用熒光定量PCR法和蛋白免疫印跡法檢測樣本中的SIRT1表達

4、量;4）用SIRT1特異性抑制劑EX527和siRNA干擾技術分別對RAW264.7巨噬細胞進行預處理并設立各自對照組，將其隨機分為空白組，LPS組和LPS+BBR組，小檗堿濃度為5umol/L，預處理24小時后，棄去藥物維持液，更換培養(yǎng)液，LPS作用濃度為100ng/ml,6小時后提取RNA樣本，采用熒光定量PCR法檢測樣本中TNF-α、IL-6、MCP-1的基因表達。
　　結果:
　　1)小檗堿低濃度(1、5umol/L

5、)對RAW264.7巨噬細胞幾乎沒有細胞毒性(P＞0.05)，而中、高濃度的小檗堿(10、50、100umol/L)對巨噬細胞活性有明顯的抑制作用(P＜0.05);
　　2)與1umol/L的小檗堿相比，5umol/L的小檗堿能夠顯著地抑制LPS誘導的巨噬細胞促炎因子TNF-α，IL-6，MCP-1的表達(P＜0.05);
　　3)在基因水平，小檗堿在基礎狀態(tài)下和炎癥狀態(tài)下均可上調巨噬細胞中SIRT1基因的表達(P＜0.05

6、)，在蛋白水平，基礎狀態(tài)下，小檗堿對巨噬細胞中SIRT1蛋白表達沒有明顯影響(P＞0.05)，而炎癥狀態(tài)下，小檗堿可以明顯上調巨噬細胞中SIRT1的表達(P＜0.05)，此外，研究還發(fā)現(xiàn)，LPS抑制巨噬細胞中SIRT1的表達(P＜0.05)。
　　4) SIRT1抑制劑EX527增加了LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞促炎因子的基因表達，同時減弱了小檗堿的抗炎作用;利用RNA干擾技術敲低RAW264.7巨噬細胞中的SIRT1，增

7、加了炎癥狀態(tài)下巨噬細胞的促炎因子的基因表達，減弱了小檗堿的抗炎作用。
　　結論:
　　1)5umol/L的小檗堿對RAW264.7巨噬細胞幾乎沒有細胞毒性，并且能夠顯著抑制LPS誘導的巨噬細胞促炎因子的表達;
　　2)基礎狀態(tài)下，小檗堿能夠上調巨噬細胞中SIRT1的基因表達，而對蛋白表達沒有顯著影響;而炎癥狀態(tài)下，小檗堿可以顯著上調巨噬細胞中SIRT1的基因和蛋白表達;
　　3)抑制SIRT1增加LPS誘導的RA