線粒體Cx43預(yù)防兔心肌缺血-再灌注損傷作用機(jī)制的研究.pdf

1、缺血心肌再灌注過(guò)程中常易發(fā)生缺血再灌注損傷，心肌IRI是臨床上常見(jiàn)的一種心肌損害現(xiàn)象，并且其機(jī)制復(fù)雜。目前心肌IRI保護(hù)的干預(yù)措施主要包括缺血預(yù)處理、藥物預(yù)處理和缺血后處理，PC、IP和藥物預(yù)處理等存在一些共同的保護(hù)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)PC具有明顯的心肌保護(hù)作用，但是其確切機(jī)理至今仍未完全闡明。近年來(lái)在體、離體的研究證實(shí)IRI早期引起Cx43脫磷酸化，縫隙連接開(kāi)放，引起壞死物質(zhì)的傳播導(dǎo)致梗死加重。GJ參與IRI，以GJ為靶點(diǎn)的抗IRI藥物可能

2、是一個(gè)新的發(fā)展方向，Heptanol作為GJ的解耦聯(lián)劑，在臨床上有潛在運(yùn)用價(jià)值。2005年Schulz等首次在心肌線粒體上發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白43的表達(dá)，線粒體Cx43在IP中作用也成熱點(diǎn)研究之一。新近研究提示心肌線粒體以及線粒體Cx43在心肌IRI損傷以及IP心肌保護(hù)中具有非常重要的作用。同時(shí)在IP心肌保護(hù)作用中線粒體ATP敏感鉀通道參與GJ調(diào)控。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討線粒體及線粒體Cx43是否參與PC和Heptanol的心肌保護(hù)

3、作用及其可能機(jī)制。
　　 本研究建立兔心肌IRI模型，給予PC和Heptanol預(yù)處理，并應(yīng)用5-羥葵酸即線粒體ATP敏感性鉀通道特異性阻滯劑，觀察PC和Heptanol對(duì)IRI兔心肌保護(hù)作用及線粒體Cx43在其中所起的作用。本課題共分為四個(gè)部分加以研究，即(1)PC及Heptanol預(yù)處理對(duì)兔IRI的影響；(2)PC及Heptanol預(yù)處理對(duì)兔IRI心肌細(xì)胞凋亡與線粒體結(jié)構(gòu)及功能的影響；(3)PC及Heptanol預(yù)處理對(duì)兔I

4、RI的細(xì)胞膜及線粒體Cx43影響；(4)mitoKATP和線粒體Cx43在缺血后處理和Heptanol預(yù)處理相關(guān)IRI中的作用。
　　 第一部分缺血后處理及Heptanol預(yù)處理對(duì)兔心肌缺血/再灌注保護(hù)作用
　　 目的：建立兔IRI模型，觀察PC、Heptanol預(yù)處理對(duì)兔IRI的保護(hù)作用。
　　 方法：80只新西蘭大白兔隨機(jī)分為5組，雌雄不分，分別為假手術(shù)組、心肌缺血/再灌注模型組、缺血預(yù)處理組，缺血后處理組以

5、及Heptanol預(yù)處理組。假手術(shù)組左冠狀動(dòng)脈前降支近端穿線但不結(jié)扎，觀察4h，其余4組則結(jié)扎30min后，松開(kāi)結(jié)扎線，予4h再灌注。分別于結(jié)扎前、結(jié)扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、再灌注4h取頸動(dòng)脈血測(cè)定血漿磷酸肌酸激酶同工酶，肌鈣蛋白以及超氧化物歧化酶與丙二醛含量以及通過(guò)頸動(dòng)脈插管測(cè)定上述5個(gè)時(shí)點(diǎn)的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。再灌注結(jié)束后，Even's和TTC染色法測(cè)心梗面積，HE染色觀察各組心肌組織結(jié)構(gòu)變化，電鏡觀察各組心肌細(xì)胞

6、超微結(jié)構(gòu)的變化。取心肌組織，制備勻漿液，測(cè)定SOD與MDA含量。
　　 結(jié)果：1.心肌酶學(xué)：與Sham組比較，其余各組CK-MB、cTnI值在結(jié)扎30min、再灌30min、再灌2h及再灌4h后明顯升高。與IR組比較，IP組、PC組和HT組的CK-MB、cTnI值在再灌30min、再灌2h和再灌4h后均明顯下降。2.血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：各組術(shù)前均無(wú)差異。術(shù)后，與Sham組比較，各處理組結(jié)扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、

7、再灌注4h的HR、MAP、±dp/d tmax均明顯降低，LVEDP明顯升高，均有顯著性差異；與IR組比較，IP、PC和HT組的MAP、±dp/d tmax和LVEDP各指標(biāo)在再灌注2h、4h明顯改善，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.心梗面積：IP，PC和HT組的心梗面積明顯小于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.心肌組織結(jié)構(gòu)的變化和心肌超微結(jié)構(gòu)的變化：光鏡與電鏡顯示結(jié)果，與Sham組比較，IR組心肌細(xì)胞損傷明顯；與IR組比較，IP、PC和HT組心肌細(xì)胞損

8、傷減輕明顯。4.心肌組織勻漿及血清中SOD與MDA變化：缺血再灌注4h后，與Sham組比較，IR組SOD活性明顯降低，MDA明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與IR組比較，IP和PC組SOD活性明顯升高，MDA明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而HT組SOD與MDA活性改變無(wú)顯著性差異。
　　 結(jié)論：PC與Heptanol預(yù)處理對(duì)兔心肌IRI的具有保護(hù)作用。
　　 第二部分缺血后處理、Heptanol預(yù)處理對(duì)兔心肌缺血/再灌注心肌細(xì)

9、胞凋亡及線粒體結(jié)構(gòu)、功能的影響
　　 目的：建立兔缺血再灌注模型，觀察PC、Heptanol預(yù)處理對(duì)兔IRI心肌凋亡、線粒體結(jié)構(gòu)及功能的影響。
　　 方法：80只新西蘭大白兔隨機(jī)分為5組，動(dòng)物模型制備、分組及納入例數(shù)均與第一部分相同。采用TUNEL法檢測(cè)各組缺血心肌細(xì)胞凋亡，用透射電鏡觀察心肌線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變，同時(shí)檢測(cè)線粒體膜電位、Ca2+濃度、丙二醛濃度、超氧化物岐化酶活性的改變。
　　 結(jié)果：與IR組比較

10、，PC、HT和IP組兔心肌細(xì)胞凋亡減少，心肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變明顯減輕；線粒體跨膜電位明顯升高、線粒體Ca2+濃度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PC、HT和IP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與IR組比較，HT組SOD與MDA改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IP組和PC組SOD活性明顯升高、MDA濃度均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：PC、Heptanol可能通過(guò)提高線粒體跨膜電位、減輕線粒體鈣超載以致改善缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷、減輕心肌凋亡

11、；PC可降低線粒體氧自由基水平，而與PC心肌保護(hù)機(jī)制不同的是，HT不能降低線粒體氧自由基水平。
　　 第三部分缺血后處理、Heptanol預(yù)處理對(duì)兔心肌缺血/再灌注損傷中細(xì)胞膜及線粒體Cx43的影響
　　 目的：探討PC、Heptanol對(duì)兔IRI中細(xì)胞膜及線粒體Cx43的影響。
　　 方法：兔80只，建立心肌IRI模型，隨機(jī)分5組，每組16只：假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血預(yù)處理組、缺血后處理組和Heptanol

12、預(yù)處理。應(yīng)用電鏡觀察各組閏盤(pán)結(jié)構(gòu)變化；應(yīng)用免疫組化、免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞膜Cx43-GJ分布及含量變化；采用差速離心法提取各組缺血區(qū)心肌線粒體蛋白，應(yīng)用Western blot檢測(cè)線粒體Cx43蛋白含量。進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平采用RT-PCR檢測(cè)Cx43mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)閏盤(pán)結(jié)構(gòu)變化與Sham組比較，IR組閏盤(pán)及GJ結(jié)構(gòu)不清，可見(jiàn)移位、斷裂。與IR組比較，IP、PC和HT組的閏盤(pán)病變明顯減輕。(2)細(xì)胞膜Cx43、GJ與

13、Sham組比較，IR組GJ重構(gòu)明顯，胞膜Cx43含量明顯減少。與IR組比較，IP、PC和HT組的GJ重構(gòu)明顯減輕，并且胞膜Cx43含量增加。(3)線粒體Cx43蛋白與Sham組比較，IR組線粒體Cx43蛋白顯著下降；與IR組比較，PC組、HT組和IP組心肌線粒體Cx43明顯升高。
　　 結(jié)論：PC、Heptanol預(yù)處理可以減輕IRI引起的閏盤(pán)損傷、細(xì)胞膜和線粒體Cx43的減少及改善GJ重構(gòu)，細(xì)胞膜與線粒體Cx43可能參與了PC

14、和Heptanol預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。
　　 第四部分線粒體ATP敏感鉀通道和線粒體Cx43在缺血后處理和Heptanol預(yù)處理相關(guān)缺血/再灌注損傷中的作用
　　 目的：探討線粒體ATP敏感鉀通道和線粒體Cx43在PC和Heptanol保護(hù)兔IRI中的作用。
　　 方法：兔112只，建立IRI模型，隨機(jī)分7組，每組16只：假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血后處理組和Heptanol預(yù)處理、缺血后處理組+5HD組和He

15、ptanol預(yù)處理+5HD組。假手術(shù)組左冠狀動(dòng)脈前降支近端穿線但不結(jié)扎，觀察4h，其余4組則結(jié)扎30min后，予4h再灌注。取血測(cè)定結(jié)扎前、結(jié)扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、再灌注4h血漿CK-MB、cTnI以及SOD與MDA含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，Even's和TTC染色法測(cè)心梗面積。電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)尤其是線粒體與閏盤(pán)結(jié)構(gòu)的變化。TUNEL法檢測(cè)缺血心肌細(xì)胞凋亡。免疫熒光檢測(cè)胞膜cx43-GJ變化以及胞膜Cx43含量，

16、差速離心法提取線粒體，并檢測(cè)線粒體膜電位、Ca2+濃度、MDA濃度、SOD活性的改變。應(yīng)用Western Blot檢測(cè)線粒體Cx43蛋白含量。進(jìn)一步用RT-PCR檢測(cè)心肌組織中Cx43mRNA改變。
　　 結(jié)果：再灌注4h末，IP、PC和HT組的血漿CK-MB、cTnI及心梗面積明顯低于IR、PC+5HD和HT+5HD組。與IR、PC+5HD和HT+5HD組比較，IP、PC和HT組兔心肌細(xì)胞凋亡減少，心肌、閏盤(pán)及線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)改

17、變明顯減輕，線粒體跨膜電位、SOD活性明顯升高，線粒體Ca2+濃度、MDA濃度均下降。免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞膜Cx43、GJ及Western Blot檢測(cè)線粒體Cx43蛋白發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，IR、PC+5HD和HT+5HD組細(xì)胞膜與線粒體Cx43蛋白顯著下降；與IR組比較，PC、HT、IP、PC+5HD和HT+5HD組心肌胞膜和線粒體Cx43明顯升高。與PC+5HD和HT+5HD組比較，IP、PC和HT組胞膜Cx43及線粒體Cx43蛋白