改良骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)也稱(chēng)骨髓基質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞,是存在于骨髓中除造血干細(xì)胞以外另一類(lèi)具有多向分化潛能的干細(xì)胞。在一定誘導(dǎo)條件下,這類(lèi)細(xì)胞可定向分化為多種造血以外的組織,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源的組織細(xì)胞,例如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。另外間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)體外獲取容易,創(chuàng)傷微小,具有無(wú)

2、限增殖和多向分化的潛能,再加上BMSCs具有貼壁生長(zhǎng)的特性,在體外易分離和擴(kuò)增,還易于外源基因的轉(zhuǎn)入和表達(dá),所以BMSCs受到醫(yī)學(xué)界的青睞,它成為一種理想的細(xì)胞治療工具和基因治療的靶細(xì)胞。開(kāi)創(chuàng)了再生醫(yī)學(xué)和組織工程的先河。然而間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中的含量很低,需要進(jìn)行體外分離純化和大量增殖。這是目前面臨的主要問(wèn)題。
　　 目的：通過(guò)觀(guān)察不同血清微環(huán)境對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖狀態(tài)的影響得到一種更適合BMSCs體外生長(zhǎng)的環(huán)境,以

3、利于改良骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法,提高體外培養(yǎng)的獲得率,以便于其體外擴(kuò)增和純化,更好的應(yīng)用于臨床治療。
　　 方法：自6-8W齡SD雄性大鼠股骨、脛骨和腓骨中分離提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)。分別給于以下三種血清微環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng):同種異體血清組:分離提取細(xì)胞后原代用含10％大鼠同種異體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),以后換液傳代時(shí)用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng);胎牛血清組:分離提取細(xì)胞后原代用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),以

4、后換液傳代時(shí)仍用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng);無(wú)血清組:分離提取細(xì)胞后原代用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),以后換液傳代時(shí)用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀(guān)察不同血清微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn),流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同血清微環(huán)境培養(yǎng)條件下的細(xì)胞表面分子CD45和CD90的表達(dá)。應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：大鼠同種異體血清微環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)較小,呈紡錘狀,網(wǎng)狀生長(zhǎng)。

5、10%胎牛血清微環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形成纖維樣,集落式生長(zhǎng)。無(wú)血清微環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞稀少,只有稍許集落式生長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)中大鼠同種異體血清組倍增速度最快,其次為10%胎牛血清組,而無(wú)血清組未見(jiàn)明顯倍增速率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下各組第三代細(xì)胞的CD90陽(yáng)性表達(dá)率均在80%以上,CD45陽(yáng)性表達(dá)率在2%以下。而在無(wú)血清培養(yǎng)條件下CD90陽(yáng)性表達(dá)率在74.09%,CD45陽(yáng)性表達(dá)率卻在6.09%。這說(shuō)明無(wú)血清微環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞純度明

6、顯低于含血清微環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞。
　　 結(jié)論：在含體積分?jǐn)?shù)為10%的大鼠同種異體血清微環(huán)境培養(yǎng)條件下所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一性好,融合度均高于其他組,且細(xì)胞首次傳代的時(shí)間明顯短于其他血清微環(huán)境。且含體積分?jǐn)?shù)為10%的大鼠同種異體血清和10%胎牛血清均適合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng),但在同種異體血清微環(huán)境下細(xì)胞增殖更快,而在無(wú)血清培養(yǎng)條件下未見(jiàn)明顯增殖現(xiàn)象。根據(jù)以上結(jié)果表明同種異體血清微環(huán)境下更適于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和純化,更有利于體