腸道病毒EV71基因檢測(cè)技術(shù)的初步研究.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)為小RNA病毒科腸道病毒屬成員,是目前腸道病毒群中最晚發(fā)現(xiàn)的病毒,其感染性強(qiáng)且致病率高,是引起手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原體。由于腸道病毒EV71對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有極高的感染性,其并發(fā)癥包括無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹(poliomyelitis-like paralysis)、急性無力肢體麻痹

2、(acute flaccidparalysis)、神經(jīng)源性肺水腫(neulrogena pulmonary edema,NPE)等,重癥患者比例、致殘率及致死率均明顯高于其他腸道病毒。而感染腸道病毒EV71患者,多為無臨床癥狀或出現(xiàn)輕微類似感冒的癥狀,常被患者忽視而轉(zhuǎn)成重癥患者,其危害性不容小覷。腸道病毒EV71感染疾病是全球性傳染病,在世界范圍內(nèi)已引起10余次大規(guī)模的暴發(fā)與流行。目前對(duì)其重癥感染尚無有效的預(yù)防疫苗及治療手段,研究相關(guān)早

3、期診斷的試劑對(duì)于手足口病的防治具有重要的臨床意義。
　　 目前常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括免疫學(xué)方法、病毒分離培養(yǎng)、PCR方法等,但都分別存在難以早期診斷、敏感度低的缺陷。由于人體對(duì)于外來病原體的免疫產(chǎn)生有一定的滯后,使得免疫學(xué)的檢測(cè)方法不能在患者患病早期得出相應(yīng)的結(jié)果,敏感性相對(duì)較低,延誤病情。病毒分離的方法雖然準(zhǔn)確,其方法復(fù)雜,操作繁瑣,容易延誤最佳時(shí)機(jī)。PCR方法雖不存在這個(gè)問題,但易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此,都不能實(shí)現(xiàn)有效確診的

4、早期診斷?；蛐酒c熒光定量PCR技術(shù)的方法,在核酸的水平上進(jìn)行檢測(cè),對(duì)人體內(nèi)所具有的相應(yīng)核酸可達(dá)到早期檢測(cè)的目的,為腸道病毒EV71的早期診斷,提供了快速、高效、敏感、自動(dòng)化的方法。
　　 本課題首先構(gòu)建了腸道病毒EV71的cDNA亞克隆,為進(jìn)一步后續(xù)建立腸道病毒EV71早期檢測(cè)方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。其次,建立了熒光定量PCR檢測(cè)方法,并對(duì)其特異性、重復(fù)性和靈敏性進(jìn)行了分析驗(yàn)證。再次,篩選設(shè)計(jì)出腸道病毒EV71的檢測(cè)探針,以構(gòu)建的

5、亞克隆作為標(biāo)準(zhǔn)品,構(gòu)建腸道病毒71型寡核苷酸芯片,為今后多病毒的聯(lián)合檢測(cè)芯片的制備打下基礎(chǔ)。
　　 本課題第一部分對(duì)腸道病毒EV71中的VP4、VP2、VP3、VP1基因進(jìn)行了長(zhǎng)片段的RT-PCR擴(kuò)增,構(gòu)建了cDNA亞克隆。由于腸道病毒EV71屬于RNA病毒,從臨床樣品中獲取的腸道病毒EV71基因組的量非常少,因此在逆轉(zhuǎn)錄過程中,對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。第一,使用二步法的反轉(zhuǎn)錄流程,將引物和RNA在65℃變性15min,消除可能存在的聚

6、合物和二聚體；37℃逆轉(zhuǎn)錄1h,溫度升高到85℃10min,消除RNA-cDNA雜交體。第二,針對(duì)RNA模板存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)及PolyA尾結(jié)構(gòu),在逆轉(zhuǎn)錄過程中,只加入隨機(jī)引物進(jìn)行延伸,隨機(jī)引物適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。雖然該過程使特異性會(huì)略微下降,但效果較為穩(wěn)定,得到cDNA產(chǎn)物較多。成功構(gòu)建的亞克隆區(qū)間包括腸道病毒EV71序列的577bp-3581bp。包括病毒的結(jié)構(gòu)蛋白 VP4序列、結(jié)構(gòu)蛋白VP3序列

7、、結(jié)構(gòu)蛋白VP2序列、結(jié)構(gòu)蛋白VP1序列。該亞克隆的構(gòu)建,不僅為后續(xù)臨床檢測(cè)方法的建立,提供了有效的陽(yáng)性質(zhì)粒；也為研究腸道病毒分型、感染、復(fù)制及基因工程疫苗的研制提供材料。
　　 熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。檢測(cè)根據(jù)所使用的標(biāo)記物不同可分為熒光探針和熒光染料。SYBR—Green染料法是熒光染料方法的典型代表。SYBR-Gr

8、een是一種雙鏈DNA集合染料,能與DNA雙鏈的小溝特異性結(jié)合,PCR反應(yīng)中高溫變性時(shí),DNA雙鏈分開,無熒光,而PCR反應(yīng)中低溫復(fù)性和延伸時(shí),形成雙鏈DNA,SYBR-Green發(fā)熒光,此階段采集信號(hào)。由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物越多,與SYBR-Green結(jié)合越多,熒光信號(hào)也就越強(qiáng)。通過釋放出的熒光值來進(jìn)行檢測(cè),可以對(duì)任何目的基因定量,此方法不需要合成高價(jià)的探針,而只需要通過設(shè)計(jì)并合成特異性強(qiáng)的引物,增強(qiáng)其特異性,達(dá)到檢測(cè)的目的。
　　

9、 本課題第二部分建立了SYBR-Green熒光定量PCR方法,檢測(cè)由腸道病毒EV71引發(fā)的手足口病。針對(duì)其保守區(qū)域VP1基因,通過軟件ABI primerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)引物,目的片段為88bp,用第一部分所構(gòu)建的亞克隆質(zhì)粒,作為陽(yáng)性模板建立SYBR-Green熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及陽(yáng)性對(duì)照,并做重復(fù)性試驗(yàn),及方法特異性的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。成功構(gòu)建的SYBR-Green熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=-3.01x+36.95,R2為

10、0.994,平均試驗(yàn)間變異系數(shù)0.945％。分別用30例手足口病的糞便樣本及30例正常人糞便樣本對(duì)此方法進(jìn)行驗(yàn)證,并與逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果相比較。
　　 寡核苷酸基因檢測(cè)芯片具有高度的特異性和靈敏性,由于寡核苷酸芯片固定的探針為特定的DNA寡核苷酸片段,眾多基因在同一張芯片上雜交,雜交條件統(tǒng)一,并經(jīng)過優(yōu)化,可防止擴(kuò)增失敗對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。選擇60mer長(zhǎng)度的寡核苷酸探針,可取得特異性及敏感度的平衡?；谝陨咸攸c(diǎn),本研究運(yùn)用寡核苷酸基

11、因檢測(cè)芯片進(jìn)行檢測(cè)。
　　 本課題的第三部分,以近年來在中國(guó)地區(qū)爆發(fā)較多的腸道病毒EV71的C4亞型基因組(登錄號(hào):FJ360544)作為研究對(duì)象。經(jīng)分析整個(gè)基因組有一個(gè)開放閱讀框,編碼含2194個(gè)氨基酸的多聚蛋白,其兩側(cè)為5’端和3’端的非編碼區(qū)域。腸道病毒EV71編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。將腸道病毒EV71的基因組全長(zhǎng)序列,分別與序列相似的的脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、?？刹《具M(jìn)行BLAST比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果剔除同源

12、性高的區(qū)域,使用軟件Allele ID6.0對(duì)同源性<40分的區(qū)段進(jìn)行二次或者三次比對(duì),分析得到結(jié)構(gòu)蛋白VP4(VP4基因)、結(jié)構(gòu)蛋白VP2(VP2基因)、結(jié)構(gòu)蛋白 VP3(VP3基因)、結(jié)構(gòu)蛋白 VP1(VP1基因)作為設(shè)計(jì)寡核苷酸探針的備選序列。運(yùn)用生物學(xué)軟件Array Designer4.2對(duì)特異性的序列進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)出長(zhǎng)度均一,各種長(zhǎng)度合適的探針20條。陽(yáng)性對(duì)照是標(biāo)記中通用引物的重復(fù)序列,陰性對(duì)照是與腸道病毒EV71沒有同源性的

13、水稻基因序列,并包括空白對(duì)照。以第一部分中 VP4、VP2、VP3、VP1基因的亞克隆,作為陽(yáng)性質(zhì)粒,對(duì)寡核苷酸探針進(jìn)行篩選；同時(shí)對(duì)也能引起手足口病的柯薩奇A組病毒16型質(zhì)粒進(jìn)行RD熒光標(biāo)記雜交,檢測(cè)探針的特異性。根據(jù)熒光信號(hào)值、信噪比,最終篩選出符合要求的高特異性和高靈敏度的寡核苷酸探針14條,即:1、2(針對(duì)VP4基因)；4、6、7(針對(duì)VP2基因)；9、10、12(針對(duì)VP3基因)；13、14、16、17、19、20(針對(duì)VP1基

14、因)。腸道病毒EV71寡核苷酸的制備,為進(jìn)一步建立多腸道病毒的聯(lián)合檢測(cè)芯片打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 綜上所述,本研究通過NCBI進(jìn)行比對(duì)分析,建立了腸道病毒EV71的cDNA亞克隆,其中包括保守區(qū)域VP4基因、VP2基因、VP3基因和VP1基因。根據(jù)國(guó)際上分型的基因VP1,建立了SYBR-Green熒光定量PCR方法,進(jìn)一步對(duì)腸道病毒EV71進(jìn)行定量分析。并根據(jù)生物學(xué)軟件對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)寡核苷酸檢測(cè)芯片,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)操作,對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,篩