雷帕霉素對(duì)大鼠抗腎小球基底膜腎炎作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 腎臟病是世界范圍的公共衛(wèi)生問題。終末期腎臟病發(fā)病率逐年升高。原發(fā)性腎小球腎炎是臨床多發(fā)病，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。研究原發(fā)性腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)制，在病變的早期階段及時(shí)的干預(yù)，對(duì)于延緩病變、減少終末期腎臟病的發(fā)病，有重要意義。 抗腎小球基底膜(glomerulus basement membrane，GBM)腎炎，又稱Goodpasture病，是一種累及腎、肺的極為兇險(xiǎn)的疾病。病起急促，預(yù)后差，死亡率高。

2、臨床表現(xiàn)為急進(jìn)性腎炎綜合癥，腎功能進(jìn)行性惡化。為揭示該病的發(fā)病機(jī)制并尋找較理想的治療方式，醫(yī)學(xué)界進(jìn)行了大量研究。大鼠抗腎小球基底膜腎炎，也稱腎毒血清性腎炎，是通過注射含有抗GBM抗體的血清導(dǎo)致大鼠腎功能惡化，出現(xiàn)新月體病理表現(xiàn)的動(dòng)物模型。該病變?yōu)槎喾N因素影響所致，體液免疫和細(xì)胞免疫共同起作用，確切機(jī)制不清。 隨著對(duì)抗腎小球基底膜腎炎發(fā)病機(jī)制的深入研究，醫(yī)學(xué)界嘗試將器官移植術(shù)后免疫調(diào)節(jié)藥物應(yīng)用于抗GBM腎炎的治療并取得一定的療效。

3、 雷帕霉素(Rapamycin，PAPA)是從吸水性鏈霉菌發(fā)酵液中提取出來的一種低毒性大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是安全有效低毒的新型免疫抑制劑。雷帕霉素受體為FK結(jié)合蛋白(FK binding proteins，F(xiàn)KBP-12)。雷帕霉素與相應(yīng)的FKBP-12結(jié)合形成復(fù)合體，通過與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶(Mammalian target of rapamycin，mTOR)結(jié)合導(dǎo)致mTOR失活，阻礙其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：p70S6蛋白激酶被抑

4、制，限制核糖體蛋白S6磷酸化及增殖細(xì)胞核抗原基因的轉(zhuǎn)錄：降低4E-BP1磷酸化，mRNA翻譯起始過程受阻；抑制p27介導(dǎo)細(xì)胞周期依賴性激酶2循環(huán)素E的激活和DNA合成，阻止細(xì)胞由G1期至S期的進(jìn)展，使細(xì)胞發(fā)育停滯在G1期。雷帕霉素強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能使其獲得了美國食品藥品管理局批準(zhǔn)，作為移植術(shù)后預(yù)防排斥一線藥物應(yīng)用于臨床。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素可以抑制生長因子介導(dǎo)的包括內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞增殖。低劑量雷帕霉素即可抑

5、制系膜細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可抑制腎臟疾病進(jìn)展中促炎癥和促纖維化基因的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素能緩解膜性腎病中小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和抑制纖維化進(jìn)程。局灶節(jié)段性腎小球硬化病變?cè)缙诮o予雷帕霉素治療能顯著減弱腎小球硬化，緩解病情進(jìn)展。雷帕霉素可抑制多囊腎大鼠的腎小管細(xì)胞增生，延緩腎功能衰竭進(jìn)程。雷帕霉素可抑制腎切除后代償性的腎肥大，可抑制UUO病變間質(zhì)纖維化進(jìn)程。雷帕霉素強(qiáng)大的抗炎、抗增殖、抗纖維化效應(yīng)，將在防治腎病中發(fā)揮重要的作用。

6、 根據(jù)上述論據(jù)，我們推測(cè)雷帕霉素可能對(duì)抗GBM腎炎具有防治作用。如果這一假設(shè)得到證實(shí)，對(duì)于雷帕霉素臨床防治抗GBM腎病將具有重要的理論指導(dǎo)意義。 第一部分： 目的： 建立大鼠抗腎小球基底膜腎炎模型，為探討該病的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)治療提供可靠穩(wěn)定的模型制備方法。 方法： 以大鼠腎皮質(zhì)勻漿反復(fù)免疫新西蘭白兔，制備兔抗鼠GBM腎毒血清。選擇16只健康雄性SD大鼠，根據(jù)體重隨機(jī)分為兩組：模型組和對(duì)照組

7、。每組8只大鼠。首先給予所有大鼠皮下注射兔1gG進(jìn)行預(yù)免疫。5天后模型組大鼠經(jīng)尾靜脈一次性注射腎毒血清，對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射正常兔血清。建模第15天殺檢，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化情況及腎臟組織病理學(xué)改變情況。用免疫組化方法檢測(cè)腎內(nèi)ED-1+(單核巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志)細(xì)胞浸潤。用ELISA法測(cè)定血清TGF-β1、MCP-1、VEGF含量： 結(jié)果： 1.模型組大鼠產(chǎn)生大量的尿蛋白，第4天、7天、14天24h尿蛋白定量均顯著高于對(duì)照組(

8、P<0.01)。 2.模型組大鼠血尿素氮、血總膽固醇升高，顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。模型組大鼠血肌酐升高，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。模型組大鼠血白蛋白水平顯著下降，低于對(duì)照組(P<0.01)。 3.模型組大鼠腎臟重量增加，顯著重于對(duì)照組(P<0.05)。 4.免疫熒光檢查顯示，模型組大鼠腎小球內(nèi)可見IgG沿腎小球毛細(xì)血管壁呈連續(xù)線狀沉積。對(duì)照組大鼠熒光抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性。 5.模型組大鼠出現(xiàn)

9、新月體和蛋白管型等病理改變，與對(duì)照組具有顯著性差異(P<0.01)。 6.免疫組化染色顯示，模型組大鼠腎小球中ED1+細(xì)胞浸潤顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。 7.ELISA測(cè)試顯示，模型組大鼠血清TGF-β1、VEGF、MCP-1水平升高，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。 結(jié)論： 給大鼠注射兔抗鼠GBM腎毒血清，成功建立大鼠抗GBM腎炎模型。該模型病程進(jìn)展快，疾病性狀顯著而且穩(wěn)定，具有很高的科研應(yīng)用價(jià)值。

10、 第二部分： 目的： 觀察雷帕霉素對(duì)大鼠抗腎小球基底膜腎炎模型的干預(yù)作用并對(duì)機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 根據(jù)第一部分的制備方法，建立大鼠抗GBM 腎炎模型。選擇健康雄性SD大鼠34只，根據(jù)體重隨機(jī)將其分為五組，分組如下：M組(n=6)，模型陽性對(duì)照組，建模后第15天殺檢；R7組(n=7)，建模后第7天起雷帕霉素(1 mg·kg-1·d-1)灌胃給藥，持續(xù)8天，建模后第15天殺檢；R4組(n=7)，建模后

11、第4天起雷帕霉素(1 mg·kg-1·d-1)灌胃給藥，持續(xù)11天，建模后第15天殺檢；R1組(n=7)，建模后第1天起雷帕霉素(1 mg·kg-1·d-1)進(jìn)行灌胃，持續(xù)14天，建模后第15天殺檢；N組(n=7)，正常對(duì)照組。觀察大鼠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化情況及腎臟組織病理學(xué)改變情況。應(yīng)用免疫組化方法觀察大鼠ED-1、PCNA、α-SMA指標(biāo)改變。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠腎臟mRNA PCNA、MCP-1、TGF-β1表達(dá)變化。應(yīng)用West

12、ern blot檢測(cè)大鼠腎臟PCNA蛋白的變化。 結(jié)果： 1.M組(模型對(duì)照組)大鼠產(chǎn)生大量的尿蛋白，第14天24h尿蛋白定量顯著高于C組(正常對(duì)照組)(P<0.01)。雷帕霉素治療后，尿蛋白減少。R4組、R1組24h尿蛋白較M組(模型對(duì)照組)顯著減少(P<0.05)。 2.M組(模型對(duì)照組)大鼠血肌酐升高，顯著高于C組(正常對(duì)照組)(P<0.05)。雷帕霉素治療后，血肌酐水平降低。R1組血肌酐較M組(模型對(duì)照組

13、)顯著下降(P<0.05)。 3.M組(模型對(duì)照組)大鼠病理檢查出現(xiàn)大量新月體和小管管型，與C組(正常對(duì)照組)差異顯著(P<0.01)。雷帕霉素治療后，腎小管管型評(píng)分沒有顯著性差異，新月體減少。R4、R1組大鼠新月體較M組(模型對(duì)照組)顯著減少(P<0.01)。 4.免疫組化ED-1染色結(jié)果：M組(模型對(duì)照組)大鼠免疫組化染色ED-1+細(xì)胞增多，顯著多于C組(正常對(duì)照組)(P<0.01)。雷帕霉素治療后，ED-1+細(xì)胞

14、減少。R4、R1組ED-1+細(xì)胞較M組(模型對(duì)照組)顯著減少(P<0.05)。 5.免疫組化PCNA染色結(jié)果：M組(模型對(duì)照組)大鼠免疫組化染色PCNA染色陽性細(xì)胞增加，顯著多于C組(正常對(duì)照組)(P<0.01)。雷帕霉素治療后，PCNA染色陽性細(xì)胞減少。其中R4、R1組PCNA染色陽性細(xì)胞較M組(模型對(duì)照組)顯著減少(P<0.05)。 6.免疫組化α-SMA染色半定量評(píng)分結(jié)果：M組(模型對(duì)照組)大鼠免疫組化α-SMA染

15、色半定量評(píng)分上升，顯著高于C組(正常對(duì)照組)(P<0.01)。雷帕霉素治療后，腎小球α—SMA半定量評(píng)分下降。其中R1組腎小球α-SMA半定量積分較M組(模型對(duì)照組)顯著減少(P<0.05)。 7.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA MCP-1表達(dá)：M組(模型對(duì)照組)大鼠腎mRNA MCP-1表達(dá)升高，顯著高于C組(正常對(duì)照組)(P<0.01)。雷帕霉素治療后，腎mRNAMCP-1表達(dá)降低。其中R1、R4組mRMA MCP-1表達(dá)較M組

16、(模型對(duì)照組)顯著減少(P<0.05)。 8.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA PCNA表達(dá)：M組(模型對(duì)照組)mRNA PCNA表達(dá)顯著增加，顯著高于C組(正常對(duì)照組)(P<0.05)。 9.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA TGF-β1表達(dá)：M組(模型對(duì)照組)大鼠腎mRNA TGF-β1表達(dá)升高，顯著高于C組(正常對(duì)照組)(P<0.01)。雷帕霉素治療后，腎mRNATGF-β1表達(dá)降低。其中R1組mRNA TGF-β1表達(dá)較M組

17、(模型對(duì)照組)顯著減少(P<0.05)。 10.用Western Blot法檢測(cè)腎PCNA蛋白水平結(jié)果表明：M組(模型對(duì)照組)大鼠腎PCNA蛋白表達(dá)升高，顯著高于C組(正常對(duì)照組)(P<0.01)。雷帕霉素治療后，PCNA蛋白表達(dá)降低。其中R4、R1組PCNA蛋白水平較M組(模型對(duì)照組)顯著減少(P<0.05)。 結(jié)論： 1.雷帕霉素能夠降低抗GBM腎炎大鼠24h蛋白尿，改善腎功能，減少新月體產(chǎn)生。 2.