應(yīng)用shotgun技術(shù)對旋毛蟲侵入相關(guān)蛋白的初步篩選.pdf

1、旋毛形線蟲[Trichinella spiralis(Owen,1835)Railliet,1895],簡稱旋毛蟲,是一種成蟲和幼蟲分別寄生在同一宿主的小腸和骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的線蟲。旋毛蟲引起的旋毛蟲病(trichinellosis)是一種危害非常嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病。當(dāng)人或動物生食或半生食含旋毛蟲的肉類后,幼蟲在胃液的作用下被消化脫囊釋放出來,迅速進(jìn)入小腸中的多細(xì)胞內(nèi)龕中。在感染性第一期幼蟲鉆入腸道柱狀上皮細(xì)胞內(nèi)龕后,稱之為旋毛蟲

2、腸道感染性第一期幼蟲(L1);經(jīng)29～36h完成4次蛻皮(L1～L4)后發(fā)育為成蟲,雌雄交配,96h后產(chǎn)出新生幼蟲,新生幼蟲經(jīng)血循環(huán)移行到肌肉組織,幼蟲在肌肉中可以生存數(shù)年而保持感染性。因此,脫囊幼蟲(腸道感染性第1期幼蟲)侵入腸粘膜內(nèi)繼續(xù)發(fā)育或是被宿主從腸道排出,是旋毛蟲能否導(dǎo)致宿主感染與致病的關(guān)鍵步驟。
　　 盡管旋毛蟲侵入腸上皮細(xì)胞的體外模型已建立,但是感染性幼蟲對腸上皮細(xì)胞的識別,侵入和移行的機(jī)制均不完全清楚。本研究模擬

3、旋毛蟲感染宿主的環(huán)境,將感染性幼蟲與小腸上皮細(xì)胞在體外共培養(yǎng),對培養(yǎng)前后的蟲體蛋白和細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離,聯(lián)合Western blot挑選出有差異的條帶,采用shotgun液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,將質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用SEQUEST軟件及數(shù)據(jù)庫搜索完成蛋白質(zhì)的鑒定,檢測旋毛蟲感染性幼蟲在侵入小腸上皮細(xì)胞前后蟲體蛋白和細(xì)胞蛋白的變化,并對鑒定出的蛋白質(zhì)從分子功能、生物學(xué)途徑、亞細(xì)胞定位三個方面進(jìn)行GOA分類。幼蟲與細(xì)胞

4、接觸后早期表達(dá)的蛋白可能是其侵入的相關(guān)蛋白,幼蟲早期表達(dá)的蛋白抗原對本病的早期診斷也可能具有重要價值。這些研究將為更深入了解旋毛蟲侵入腸上皮細(xì)胞機(jī)制提供有力的數(shù)據(jù)支持和參考。
　　 材料與方法:
　　 1.旋毛蟲蟲種、實驗動物及細(xì)胞系本實驗所用的旋毛蟲為河南省南陽豬源旋毛蟲(Trichinella spiralis),由本室昆明小鼠傳代保種。20只雄性6周齡昆明小鼠(清潔級),體重20g～25g,均購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗

5、動物中心。人回盲腸癌細(xì)胞HCT-8[HRT-18]購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。
　　 2.旋毛蟲肌幼蟲的收集與激活將旋毛蟲肌幼蟲按照300條/只經(jīng)口感染50只昆明小鼠,42 d后脫頸椎處死。膈肌壓片鏡檢證實感染成功后,剝皮、除內(nèi)臟和脂肪,用攪拌器攪碎至肌肉完全攪碎。采用人工消化法消化4 h,按貝氏法收集肌幼蟲。將收集的肌幼蟲用含5％人膽汁的PBS在37℃5%CO2條件下孵育2～3 h,用PBS洗滌3次后,加入含抗生素的PBS中37℃孵

6、育1h備用。
　　 3.細(xì)胞培養(yǎng)將HCT-8細(xì)胞接種在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),2～3d即可形成致密的單細(xì)胞層,此時用于接種肌幼蟲。在接種前1d按照常規(guī)方法給細(xì)胞換液,以及時去除死細(xì)胞,保證細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　 4.旋毛蟲蟲體蛋白和HCT-8細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot鑒定將激活的肌幼蟲與RPMI-1640培養(yǎng)基按5000條/ml的比例混合后加入長滿HCT-

7、8細(xì)胞的75ml培養(yǎng)瓶中,37℃5%CO2條件下培養(yǎng)18 h后,去除培養(yǎng)基與幼蟲,收集肌幼蟲,加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后收集細(xì)胞,按比例分別加入RIPA裂解液提取蟲體蛋白和細(xì)胞蛋白。BCA法測得蟲體蛋白和細(xì)胞蛋白后,利用SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡(Western blot)進(jìn)行分析。
　　 5.LC-MS/MS分析根據(jù)Western blot的結(jié)果,比對膠上相匹配的差異條帶。用手術(shù)刀片將膠上差異部分切割下

8、來,胰酶酶解、抽提肽段。酶解后得到的肽段提取物使用LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析,質(zhì)譜設(shè)備為Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀LTQ,microspray模式。質(zhì)譜儀配置C-18反相色譜柱,流動相A相為0.1%溶于超純水的甲酸,B相為0.1%溶于乙睛水溶液中的甲酸。肽段混合物的洗脫梯度:2%～80%,洗脫時間60min,重復(fù)三次。串聯(lián)質(zhì)譜分析包括一個全掃描(fullMS scan)和十個串聯(lián)掃描(MS/MS scan)。
　　

9、6.質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和處理數(shù)據(jù)搜索引擎為Bioworks version3.2software(SEQUSET,Thenno Electron)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。肽段數(shù)據(jù)經(jīng)SEQUEST過濾、匹配,只有分值較高的肽段被保留。過濾參數(shù)為:當(dāng)Charge+1,Xcorr≥1.9:當(dāng)Charge+2,Xcorr≥2.2:當(dāng)Charge+3,Xcorr≥3.75:其中DelCN≥0.1。最后得到胰酶消化的蛋白質(zhì)信息列表數(shù)據(jù)。
　　 7.I

10、nterPro注解和GO分類使用EXPASY工具在線分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)(包括分子量Mr、等電點pI等),最后用圖表進(jìn)行展示。使用InterProscan軟件完成對蛋白序列的搜索。采用GO工具,從生物學(xué)途徑、亞細(xì)胞定位及分子功能三方面對蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行功能分析及分類,并通過WEGO在線分析展示各部分分布。
　　 結(jié)果:
　　 1.幼蟲與HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)后蟲體蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析SDS

11、-PAGE結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h的蟲體抗原有41條蛋白帶。HCT-8細(xì)胞與幼蟲培養(yǎng)后的蟲體蛋白增加了9條蛋白帶(15、29、31、35、37、58、69、121和132 kDa),減少了4條蛋白帶(12、17、40、51 kDa)。Western blot結(jié)果顯示,幼蟲在培養(yǎng)基中孵育18h后蟲體蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血清識別的有18條帶,分子量范圍為18 kDa～135 kDa,幼蟲和HCT-8細(xì)胞孵育后與僅在培養(yǎng)基中孵育的幼蟲

12、相比,被旋毛蟲感染鼠血清多識別了7條蛋白帶(21、28、30、36、58、77和123 kDa),少識別了3條蛋白帶(23、51、97 kDa)。
　　 2.LC-MS/MS分析和鑒定旋毛蟲幼蟲蛋白旋毛蟲感染性幼蟲和HCT-8細(xì)胞共孵育后,被感染旋毛蟲鼠血清識別的3條蛋白帶被從膠上切離下來,分子量分別為21、36及58 kDa。應(yīng)用shotgun LC-MS/MS和生物信息學(xué)分析,共有211個非冗余蛋白質(zhì)被鑒定出來。在高可信度蛋

13、白質(zhì)當(dāng)中,有67.8%的蛋白相對分子量范圍為20 kDa～65 kDa。對于等電點來說,有123種(58.3%)蛋白質(zhì)的等電點范圍為4～7,58種(28.9%)蛋白的等電點范圍為8～10。少于8.5%的蛋白等電點范圍為7～8,10種(3.8%)蛋白質(zhì)具有較高的等電點(大于10)。
　　 3.旋毛蟲幼蟲蛋白根據(jù)GO進(jìn)行功能分類對鑒定出的旋毛蟲的211種蛋白,利用GO工具,從生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞定位三個方面進(jìn)行分類。旋毛蟲蛋白

14、的分子功能共分為10大類,其中催化活性(75種蛋白,17.5%)和蛋白結(jié)合(110種蛋白,25.6%)是兩大主要功能。大部分的細(xì)胞和代謝過程與大分子的合成和降解有關(guān),尤其是糖類,核苷酸和蛋白可能是感染性幼蟲在發(fā)育和生長過程中釋放出來的。在211種蛋白中,139種蛋白位于細(xì)胞中,105種位于細(xì)胞器中。
　　 4.HCT-8細(xì)胞與幼蟲培養(yǎng)后細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析SDS-PAGE結(jié)果表明,正常的HCT

15、-8細(xì)胞有44條蛋白帶。HCT-8細(xì)胞與幼蟲培養(yǎng)后的細(xì)胞蛋白與正常HCT-8細(xì)胞蛋白相比增加了5條蛋白帶(19、34、61、128和132 kDa),減少了1條蛋白帶(118 kDa)。Western blot結(jié)果顯示,正常HCT-8細(xì)胞的蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血清識別的有5條帶,分子量范圍為30～129 kDa;HCT-8細(xì)胞與幼蟲培養(yǎng)后與培養(yǎng)前的HCT-8細(xì)胞相比,被旋毛蟲感染鼠血清多識別了4條蛋白帶(24、35、61和115 kD

16、a)。
　　 5.LC-MS/MS分析HCT-8細(xì)胞蛋白HCT-8細(xì)胞與幼蟲共孵育后,被旋毛蟲感染鼠血清多識別的細(xì)胞蛋白的分子量分別為24、35、61 kDa,將這3條蛋白帶通過shotgun LC-MS/MS進(jìn)行進(jìn)一步分析。共有64種非冗余蛋白被鑒定出來。有43種蛋白(67.2%)分子量范圍分布在10～70 kDa。等電點的范圍為4.7～10.92,其中有26種蛋白(40.6%)的等電點在5～6。
　　 6.HCT-8

17、細(xì)胞與幼蟲共孵育后增加的蛋白通過GO進(jìn)行基因分類利用GO工具,64種非冗余蛋白中共有54種蛋白質(zhì)的功能已知。腸上皮細(xì)胞與幼蟲共孵育后細(xì)胞中的旋毛蟲蛋白有注解的與細(xì)胞成分有關(guān)。其中46種蛋白在細(xì)胞中,35種在細(xì)胞器中。根據(jù)GO的分子功能分類,共可分為7大類,其中結(jié)合功能(43,79.6%)和催化活性(23,42.6%)仍然是兩大主要功能。大部分的蛋白參與了生物進(jìn)程,主要是細(xì)胞過程、新陳代謝、生物進(jìn)程的調(diào)控及應(yīng)激和信號傳導(dǎo)。
　　

18、結(jié)論:
　　 1.旋毛蟲幼蟲與HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)后,被感染鼠血清多識別的7條蟲體蛋白帶(21、28、30、36、58、77和123 kDa)可能是幼蟲與細(xì)胞接觸后分泌的新蛋白;少識別的3條蛋白帶(23、51、97 kDa)可能是被HCT-8細(xì)胞釋放的蛋白酶水解掉的蟲體蛋白或是蟲體發(fā)育過程中期特異性蛋白的改變。
　　 2.HCT-8細(xì)胞與旋毛蟲幼蟲與培養(yǎng)后,被感染鼠血清多識別的4條細(xì)胞蛋白帶(24、35、61和115 kD