四季杧AP1和SEP1同源基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、杧果(Mangifera indica Linn.)是世界上重要的熱帶果樹(shù)之一,也是廣西主要熱帶果樹(shù)之一。AP1(APETALA1)與SEP1(SEPALLATA1)同源基因在花器官的形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在擬南芥中,AP1與SEP1基因相互作用共同促進(jìn)植株開(kāi)花。本試驗(yàn)從四季豐亡中分離克隆AP1、SEP1同源基因cDNA全長(zhǎng)序列,并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)信息分析;同時(shí)初步比較了四季杧AP1的2個(gè)同源基因、SEP1同源基因在不同組織器官中

2、表達(dá)以及在四季杧和紫花杧這兩個(gè)品種表達(dá)的差異,以期了解四季杧開(kāi)花的分子機(jī)制,為進(jìn)一步闡明四季杧的成花機(jī)理積累資料。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)杧果RNA提取方法的優(yōu)化。本方法在前人的基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化改進(jìn),細(xì)化了步驟,并能普遍適用于杧果不同組織RNA提取方法。采用優(yōu)化后的RNA提取方法,提出的杧果RNA純度高、條帶清晰、完整性好,OD260/OD280值保持在1.8-2.0之間,產(chǎn)率相對(duì)較高。所有樣品均可用于RT-PCR

3、,并均能擴(kuò)增出清晰的單一條帶,該方法提取的RNA完全適用于下一步分子生物學(xué)研究。
　　 (2)杧果AP1同源基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆及生物信息學(xué)分析。以四季杧花的cDNA為模板,用AP1同源基因簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增,得到一條長(zhǎng)度為950bp的特異條帶。測(cè)序后進(jìn)行Blast檢索,成功獲得AP1的兩個(gè)同源基因,被命名為MSAP1-1和MSAP1-2,(GenBank登錄號(hào)分別為:GQ152892和GQ152893)。MSAP1-1和MSA

4、P1-2同源基因分別與紫花杧的MAP1-1和MAP1-2同源基因相對(duì)應(yīng)。在核苷酸水平上,MSAP1-1與MSAP1-2核苷酸同源性為87％;;MSAP1-1與MAP1-1和MAP1-2核苷酸同源性分別為98％,87％;MSAP1-2與MAP1-1和MAP1-2核苷酸同源性分別為87％,98％。經(jīng)過(guò)氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),四季卡亡AP1同源基因與其它植物AP1同源基因具有較高同源性,且此類(lèi)基因含有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,即MADS-

5、box保守結(jié)構(gòu)域與K-box功能域。
　　 (3)杧果SEP1同源基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆及生物信息學(xué)分析。以四季杧花cDNA為模板,用SEP1同源基因簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增,得到一條長(zhǎng)度約為900bp的特異條帶。測(cè)序后進(jìn)行Blast檢索,成功獲得卡亡果SEP1同源基因,被命名為SEP1,(GenBank登錄號(hào)為:HQ586001)。經(jīng)過(guò)氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),四季杧SEP1同源基因與其它物種的核苷酸序列同源性基本在70％以

6、上,通過(guò)氨基酸同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),杧果SEP1基因與其它植物的SEP1基因具有較高同源性,且此類(lèi)基因含有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,即MADS-box保守結(jié)構(gòu)域與K-box功能域。
　　 (4)杧果AP1、SEP1同源基因的表達(dá)模式分析。采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)四季杧AP1的2個(gè)同源基因以及SEP1同源基因在不同器官中的表達(dá)水平,同時(shí)檢測(cè)這些同源基因在四季杧和紫花杧這兩個(gè)品種表達(dá)的差異。結(jié)果分析表明,四季杧MSAP1-1和MSAP1-2

7、同源基因均在花和果實(shí)中表達(dá),且在花中具有較高的表達(dá)量,在花后60天(坐果后期)表達(dá)量明顯高于花后20天(坐果初期)和花后40天(坐果中期)中的表達(dá)量。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)調(diào)控中,四季杧幼嫩組織中AP1同源基因具有較高的表達(dá)量,而在老葉中不表達(dá)。SEP1同源基因在四季杧和紫花杧的花器官中以及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)器官嫩葉、嫩莖、老葉、老莖中均有表達(dá)。其中,SEP1在老莖中微量表達(dá),在花和老葉中的表達(dá)量較高。AP1的2個(gè)同源基因、SEP1同源基因在四季杧與紫花杧中