低溫脅迫下凹葉厚樸差減文庫的構建及ESTs序列分析.pdf

1、凹葉厚樸差減文庫的構建及序列分析可以有效找出其主要抗寒相關功能基因，分析代謝途徑。進而對與凹葉厚樸親緣關系相近的植物抗低溫特性遺傳育種提供理論基礎，并且有助于對植物的自然栽培的研究。實驗從植物低溫脅迫到最終測序的差減文庫構建過程中共做了三次重復，以減少非抗寒相關基因在文庫中所占的單個比例。具體研究結果如下:
　　1、對凹葉厚樸在不同溫度下的電導率進行測定，運用Logistic方程Y=K/(l+aebx)進行擬合數(shù)據(jù)處理，得回歸方程

2、為：y=0.7526/(1+18.925e-0.372x)，半致死溫度為-7.93℃。
　　2、取兩盆凹葉厚樸苗每放于25℃人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，七天后將一盆凹葉厚樸留于人工氣候培養(yǎng)箱中，作為Driver組。將另一盆凹葉厚樸于生長期轉(zhuǎn)移-8℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，作為Tester組。用Trizol法提取了植物總RNA，利用SMART法合成全長cDNA，后進行兩輪差減雜交與兩輪抑制性擴增得到雜交產(chǎn)物。插入片段的平均長度為0.

3、65 kb，藍白斑檢測重組率為99.9％。
　　3、三次重復實驗測序后共獲得了837條可用于后續(xù)分析的EST序列，將837條EST序列分別進行聚類拼接得到286條unigene-1，將unigene-1在NR數(shù)據(jù)庫進行比對，選出了unigene-1比對結果相同或類似的基因合集171條unigene-2，將unigene-2進行第二次拼接得到60條unigene-3。
　　4、將60條unigene-3進行NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫比

4、對注釋。注釋結果顯示有較多與抗逆相關蛋白如鋅指家族蛋白、硫氧還蛋白、乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子、過氧化物酶等。
　　5、將60條unigene-3在blast2GO進行功能分類，結果共獲得144個GO terms這些GO terms歸為3類：其中生物學過程所占的GO terms最多(67)，占46.52%，其次是分子功能(42)，和細胞組件(35)，分別占29.17%和24.31%。物種相似性最高為蓮與葡萄，其次為麻瘋樹、柑橘、青梅、山胡椒

5、、胡楊、油棕等。144個GO term中直接參與對對外界刺激的防御反應的有6個，如：對刺激的反應、信號、刺激細胞反應、核酸結合轉(zhuǎn)錄因子活性、氧化還原酶活性、磷酸酶活性等，占4.16%。
　　6、在對60條unigene-3的信息處理后。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫比對出的結果以及GO功能分類的結果，篩選出了11個最有可能參與抗寒應激防御的基因：FLS基因、F-box基因、LHCB1基因、WRKY基因、HSP70基因、APX基因、PP2C基因

6、、Trx基因、ERF基因、DREB基因、GAPDH基因。
　　7、熒光定量pcr顯示F-box、APX、TRX、ERF、DREB等基因都隨著溫度的較低表達量不斷增加，LHCB、WRKY、HSP、PP2C、GAPDH等在-8℃低溫時由于溫度過低代謝受到抑制因此表達量有所下降。ERF的基因表達量隨著溫度的降低而升高證明了這兩個基因與溫度的相關性較強。但在溫度過低時植物代謝受到阻礙，基因的表達受到抑制，這是由于低溫破壞了基因正常的代謝途