十字花科黑腐病菌與細(xì)胞絮凝相關(guān)基因的篩選與功能研究.pdf

1、十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)屬于一種γ變形菌，是十字花科植物黑腐病的病原菌。目前已經(jīng)證實(shí)Xcc的致病性取決于多種因素，其中包括調(diào)控毒力因子表達(dá)和生物聚膜形成與解離的細(xì)胞信號(hào)通訊系統(tǒng)(cell-cellcommunication)。群體感應(yīng)是細(xì)菌對(duì)細(xì)胞密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的一種生理行為。由于環(huán)境條件往往迅速變化，細(xì)菌需要迅速作出反應(yīng)，以求生存。群體感應(yīng)系統(tǒng)能使細(xì)菌能夠

2、快速協(xié)調(diào)自身行為以逃避宿主的免疫反應(yīng)，所以它在病原菌侵染宿主的過程中發(fā)揮著重要作用。生物聚膜是細(xì)菌應(yīng)對(duì)不同的環(huán)境信號(hào)所形成從浮游生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂L(zhǎng)狀態(tài)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，rpfG編碼一種磷酸二酯酶，可用來降解第二信使Cyclicdi-GMP。在rpfG突變體中，毒力因子的表達(dá)大幅度下降。pfG突變體在LB培養(yǎng)基中呈現(xiàn)細(xì)胞聚集生長(zhǎng)狀態(tài)。在先前的工作中，我們已鑒定出8個(gè)和野生型Xcc8004表型不同的Tn5插入突變體，然后我們構(gòu)建了這8個(gè)基因的整合

3、突變體。通過篩選突變體庫(kù)中的一部分突變體和上述的8個(gè)整合突變體，我們篩選出一個(gè)與細(xì)胞聚集表型有關(guān)的新基因，在LB培養(yǎng)基中，XC0831突變體成絮凝生長(zhǎng)狀態(tài)，形成可視的菌團(tuán)。本研究中用pK18mob質(zhì)粒整合進(jìn)編碼假設(shè)蛋白的XC0831基因中構(gòu)建出突變體菌株。結(jié)果顯示XC0831突變后導(dǎo)致細(xì)胞絮凝，游動(dòng)性降低，以及毒力因子胞外酶和胞外多糖產(chǎn)量下降。另外，植株侵染實(shí)驗(yàn)顯示XC0831突變體的致病力與野生型相比大幅度下降。為了準(zhǔn)確分析該基因的功

4、能，本工作構(gòu)建了XC0831的反式功能互補(bǔ)菌C0831和高表達(dá)菌株E0831。結(jié)果表明，C0831的各種表型基本得到恢復(fù)，而E0831的表型和野生型菌株基本一致。本研究還檢測(cè)了XC0831突變體對(duì)重金屬離子、滲透壓、有機(jī)溶劑等一些環(huán)境脅迫因子的耐受能力。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)XC0831的突變影響了Xcc8004的抗逆性。此外，通過對(duì)過敏反應(yīng)的的檢測(cè)以及在基本培養(yǎng)基和豐富培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該基因和過敏反應(yīng)無關(guān)，其突變體在液體的基本培養(yǎng)