單核細胞趨化蛋白1誘導(dǎo)蛋白調(diào)節(jié)BV-2細胞的炎癥因子表達.pdf

1、目的：
　　1.明確LPS或OGD/R干預(yù)下是否可誘導(dǎo)MCPIP在BV-2細胞中表達。
　　2.在LPS刺激下，探究MCPIP被敲低后是否增加BV-2細胞炎癥因子表達并加重LPS誘導(dǎo)BV-2細胞的神經(jīng)元毒性。
　　方法：
　　1.LPS刺激BV-2細胞誘導(dǎo)MCPIP表達
　　小鼠小膠質(zhì)細胞株BV-2細胞用DMEM培養(yǎng)基加10％胎牛血清Fetal BovineSerum，F(xiàn)BS)培養(yǎng)，當BV-2細胞生長密度約

2、80％時，用LPS(1μg/ml)在不同時間點(4，8，12及24h)分別刺激細胞。另外用不同濃度LPS(0.1，0.3及1μg/ml)分別刺激BV-2細胞4h，每組獨立重復(fù)3次。最后用常規(guī)RT-PCR和Westernblot方法分別檢測mRNA和蛋白表達水平，明確LPS刺激下BV-2細胞表達MCPIP的變化。
　　2.建立BV-2細胞的體外缺氧再灌注模型
　　用BV-2細胞進行OGD/R處理，模擬體外缺血再灌注狀態(tài)。將OG

3、D與REOX不同時間點之間的組合，將BV-2細胞分成7組，OGD1h/R3h、OGD1h/R24h、OGD2h/R3h、OGD2h/R24h、OGD4h/R3h、OGD4h/R24h及正常對照組，每組獨立重復(fù)3次。用Western blot方法明確不同OGD/R時間點組合誘導(dǎo)BV-2細胞表達MCPIP的表達變化。
　　3.確立siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細胞的轉(zhuǎn)染時間
　　將MCPIP特異性siRNA轉(zhuǎn)染到BV-2細胞中（siMC

4、PIP組），錯義序列siRNA作為陰性對照(siControl組)。根據(jù)說明書操作說明將Lipofectamine2000(5μl/ml)和siRNA(50pM)混合后加到細胞培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染。實驗分為2組，一組siRNA轉(zhuǎn)染細胞24h，另外一組siRNA轉(zhuǎn)染細胞48h，實驗獨立重復(fù)3次，采用常規(guī)RT-PCR及DNA凝膠電泳最后確認轉(zhuǎn)染效率，摸索轉(zhuǎn)染效率較好的轉(zhuǎn)染時間。
　　4.檢測MCPIP敲低后BV-2細胞炎癥相關(guān)因子的表達變化<

5、br>　　實驗分為兩組，siMCPIP組以及siControl組。轉(zhuǎn)染后用相同濃度LPS(1μg/ml)刺激BV-2細胞4h，提取總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行熒光定量RT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)，特異性擴增MCPIP以及炎癥因子IL-12b、IL-6、IL-1β、IL-23、即刻早期反應(yīng)蛋白3(immediate early response3

6、，IER3)、腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosisfactor receptor2，TNFR2)、可誘導(dǎo)刺激分子(inducible costimulator，ICOS)的cDNA。實驗獨立重復(fù)3次，相對RNA表達量用2-ΔΔCt方法計算。
　　5.檢測MCPIP敲低后BV-2細胞上清的對SH-SY5Y的神經(jīng)元毒性
　　實驗分為兩組，siMCPIP組及siControl組。 BV-2細胞完成轉(zhuǎn)染后，用LPS(0.

7、1μg/ml)刺激細胞4h換新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h并收集細胞上清。將細胞上清與神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y細胞共孵育6h。3次獨立重復(fù)實驗，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法測量SH-SY5Y細胞的細胞存活率;用乳酸脫氫酶(dehydrogenase，L

8、DH)釋放實驗測量SH-SY5Y細胞的死亡率。
　　6.統(tǒng)計分析
　　本研究全部數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，兩獨立樣本實驗方差齊的數(shù)據(jù)采用Student's t檢驗方法，方差不齊的數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗。統(tǒng)計學結(jié)果以平均值±標準差((X)±S)表示，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.常規(guī)RT-PCR以及Western blot結(jié)果表明，相同濃度的LPS(1μg/ml)分

9、別刺激BV-2細胞4、8、12和12h，LPS刺激4h后MCPIP的mRNA表達即顯著增加并持續(xù)至24h（P＜0.01)。與此不同的是，MCPIP的蛋白表達水平也呈現(xiàn)時間依賴性，從4h開始緩慢增加并在12h到達表達高峰，但在LPS刺激24h后MCPIP蛋白表達明顯下降。另外，不同濃度的LPS(0.1、0.3、1μg/ml)刺激BV-2細胞均可明顯誘導(dǎo)MCPIP表達增高（P＜0.05)。
　　2.不同OGD/R時間點組合的干預(yù)下能誘

10、導(dǎo)BV-2細胞MCPIP蛋白表達增加。Western blot結(jié)果表明OGD2h/R3h、OGD2h/R24h兩組對BV-2細胞表達MCPIP蛋白的誘導(dǎo)能力較強。
　　3.BV-2細胞轉(zhuǎn)染siRNA48h(P＜0.05)較24h(P＞0.05)能得到較好的敲低效率，siRNA轉(zhuǎn)染48h后QRT-PCR結(jié)果顯示MCPIP的敲低效率可達約60％。LPS刺激下，對siControl組，MCPIP敲低后會導(dǎo)致BV-2細胞的IL-6、IL-

11、12b的mRNA表達增加（P＜0.05)，卻顯著降低了立即早期反應(yīng)蛋白3(immediate earlyresponse3，IER3)的mRNA表達（P＜0.05），其他的炎癥因子IL-1β、IL-23、TNFR2、ICOS的mRNA表達變化較陰性對照組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　4.LPS刺激BV-2細胞后收集細胞上清，然后將細胞上清與SH-SY5Y細胞共孵育后研究發(fā)現(xiàn)，MCPIP敲低后BV-2細胞的細胞上清具有更大的神

12、經(jīng)元毒性。對比siControl組，MCPIP敲低后的細胞上清與SH-SY5Y細胞共孵育，SH-SY5Y細胞存活率降低（P＜0.05）且細胞死亡率更高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過體外實驗驗證了小膠質(zhì)細胞株BV-2細胞可被LPS或OGD/R誘導(dǎo)表達MCPIP的表達，可為將來更進一步顱內(nèi)炎癥相關(guān)性疾病研究提供研究基礎(chǔ)。
　　2.LPS刺激下，MCPIP調(diào)節(jié)BV-2細胞中炎癥因子的表達，MCPIP敲低后