石斛屬藥用植物內(nèi)生真菌多樣性研究.pdf

1、石斛屬植物為附生性蘭科植物，多種具有藥用價(jià)值。自然條件下所有石斛屬植物均與內(nèi)生真菌共生，內(nèi)生真菌在石斛屬植物整個(gè)生活史中扮演著重要角色。針對(duì)石斛屬植物內(nèi)生真菌的研究得到了大量學(xué)者的重視，但是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外針對(duì)石斛屬植物內(nèi)生真菌多樣性的研究少有報(bào)道。本研究以石斛屬植物為研究對(duì)象，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定對(duì)24種石斛屬藥用植物中分離到的542株內(nèi)生真菌進(jìn)行了多樣性研究。 鑒于大量?jī)?nèi)生真菌不產(chǎn)孢無法通過形態(tài)學(xué)鑒定的現(xiàn)實(shí)，我們首先對(duì)內(nèi)生真

2、菌產(chǎn)孢誘導(dǎo)的方法進(jìn)行了篩選。本研究選用美登木、金線蓮兩種藥用植物來源的74株常規(guī)條件下不產(chǎn)孢的內(nèi)生真菌進(jìn)行了產(chǎn)孢誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明低溫誘導(dǎo)對(duì)內(nèi)生真菌產(chǎn)孢誘導(dǎo)效果較為理想，因而在我們對(duì)石斛屬藥用植物內(nèi)生真菌不產(chǎn)孢菌株采用低溫誘導(dǎo)法誘導(dǎo)產(chǎn)孢。在該實(shí)驗(yàn)過程中，我們從金線蓮內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)一個(gè)Hansfordia的新種，定名為Hansfordia pallens。 542株石斛屬藥用植物內(nèi)生真菌中249株可產(chǎn)孢，占總菌株數(shù)的46％。通過形

3、態(tài)學(xué)觀察249株石斛內(nèi)生真菌鑒定到21個(gè)屬，其中148株鑒定到種，分別屬于51個(gè)種，其中發(fā)現(xiàn)3個(gè)中國(guó)新紀(jì)錄種(Acremonium sordidulum，Periconiella cestri，Hyalodendron lignicola)。Alternaria，Cladosporium，Aureobasidium，Chaetophoma，Periconiella，Nigrospora,Hyalodendron，Thielavia，Pl

4、europhragmium，Melanconium，Glomerularia，Sirodesmium，Chaetomella，Streptomyces 14個(gè)屬系首次從石斛屬植物中發(fā)現(xiàn)。 雖然我們對(duì)石斛屬藥用植物不產(chǎn)孢的內(nèi)生真菌進(jìn)行了產(chǎn)孢誘導(dǎo)，但仍有293株不產(chǎn)孢，無法通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行鑒定。對(duì)于不產(chǎn)孢的菌株，我們采用分子生物學(xué)手段來對(duì)其進(jìn)行鑒定。根據(jù)菌落培養(yǎng)特征和顯微觀察特征，將不產(chǎn)孢菌株劃分為30個(gè)形態(tài)型，從30個(gè)形態(tài)型

5、中選取148個(gè)代表菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。對(duì)148株內(nèi)生真菌的ITS片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，將獲得的ITS序列與參考菌種一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合序列堿基相似性比對(duì)來確定石斛屬藥用植物內(nèi)生真菌的分類地位。通過分子生物學(xué)鑒定，148株代表菌株中8株鑒定到種，分別屬于8個(gè)不同種；128株鑒定到屬，分別屬于28個(gè)屬； 10株鑒定到科，分別屬于5個(gè)科；2株放到目。形態(tài)學(xué)鑒定的28個(gè)屬中，Arthrinium,Chaetomium，Col

6、letotrichum，Cercophora,Phomopsis，Nectria，Cosmospora, Bionectria,Nemania, Pleospora,Leptosphaerulina,Lewia，Paraconiothyrium,Ampelomyces,Davidiella，Lasiodiplodia,Fusicoccum，Botryosphaeria，Pezicula，Hypocrea 20個(gè)屬系首次從石斛屬植物中發(fā)現(xiàn)