人osteostat胞外段在大腸桿菌中的表達(dá)和生物活性分析.pdf

1、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體的配體(glucocorticoid-induced tumornecrosis factor receptor ligand，GITRL)是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosisfactor superfamily，TNFSF)中的第18個(gè)成員，主要在樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，屬于Ⅱ型跨膜蛋白。新近的一項(xiàng)研究顯示，它抑制由RANK介導(dǎo)的外周血單個(gè)核細(xì)胞向破骨細(xì)

2、胞的分化，具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，因此稱之為Osteostat。目前，對它調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的機(jī)制還知之甚少。
　　 Osteostat蛋白分為胞內(nèi)段、胞外段和跨膜區(qū)三個(gè)部分，胞外段含有C-類凝集素的基序?；诖?，我們采用基因工程的方法，在大腸桿菌中表達(dá)Osteostat胞外段重組蛋白，并應(yīng)用報(bào)告基因技術(shù)檢測其生物活性。
　　 本文根據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏嗜性和密碼子的簡并性原則，在不改變氨基酸序列的條件下，將Osteost

3、at的胞外段密碼子全部替換成大腸桿菌偏嗜的密碼子。利用重組PCR技術(shù)獲得大腸桿菌偏嗜性O(shè)steostat的胞外段DNA序列。先將其克隆入pTA2中，經(jīng)測序正確后，再將其插入原核表達(dá)載體pQE-30Xa，獲得成功構(gòu)建的重組表達(dá)載體pQE/Osteostat。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coliM15[pREP4]進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在37℃、0.5 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)條件下，將誘導(dǎo)表達(dá)菌制備細(xì)胞抽提物，可溶部分和沉淀部分分別行SDS-PAGE

4、，觀察到細(xì)胞裂解物沉淀在預(yù)期分子量位置有明顯的蛋白表達(dá)條帶。免疫印記Western-blotting顯示預(yù)期位置蛋白可與抗His抗體發(fā)生免疫識別，證明此重組蛋白確系His-Osteostat重組融合蛋白。改變表達(dá)目的蛋白的溫度、時(shí)間和誘導(dǎo)劑的濃度，優(yōu)化目的蛋白表達(dá)的條件，獲得最適的表達(dá)條件：表達(dá)溫度37℃，加入誘導(dǎo)劑IPTG后表達(dá)時(shí)間6小時(shí)，誘導(dǎo)劑IPTG的使用濃度為0.5 mM。目的蛋白含6×His純化標(biāo)簽，可以經(jīng)金屬螯合親和層析吸附

5、于Ni-NTA樹脂層析柱，沖洗除去非特異吸附的雜蛋白后，將目的蛋白洗脫，獲得目的蛋白的初級純品。通過透析的方法除去洗脫液中的咪唑、尿素和一些鹽離子。利用BCA法測得透析液總蛋白濃度，并將透析液行SDS-PAGE還原凝膠電泳，UVP凝膠分析系統(tǒng)分析純化后融合蛋白的純度。
　　 GITRL的受體為GITR(glucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor)，也叫做糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)

6、的腫瘤壞死因子受體，是腫瘤壞死因子受體超家族成員。大量研究表明，GITRL/GITR具有許多生物學(xué)活性，包括細(xì)胞的增殖、分化和存活等。國外一項(xiàng)研究顯示：GITRL/GITR配受體結(jié)合可以激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路?；谶@樣的發(fā)現(xiàn)，我們通過報(bào)告基因技術(shù)檢測重組Osteostat胞外段蛋白的生物學(xué)活性。首先，構(gòu)建人GITR編碼基因的表達(dá)載體，建立穩(wěn)定表達(dá)GITR基因的HEK293細(xì)胞株。然后，用包含NF-κB增強(qiáng)子序列的報(bào)告基因載體(luc