金絲桃素光動力對鮮紅斑痣的治療作用及機制研究.pdf

1、鮮紅斑痣（port wine stains，PWSs）是一種先天性難消退的真皮淺層毛細(xì)血管增生畸形，其病變組織中血管密度明顯增高。PWSs好發(fā)于面頸部，臨床表現(xiàn)為淡紅、暗紅或紫紅色斑片，隨著年齡的增長，血管不斷擴張增生，有約2/3的患者，可出現(xiàn)斑塊顏色加深且彌漫性增厚的現(xiàn)象，并可凸起形成結(jié)節(jié)，將對患者產(chǎn)生嚴(yán)重的生理及心理影響。研究顯示，光動力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)已成功地用于治療PWSs。然而，傳統(tǒng)光

2、敏劑(photosensitizers，PS)血卟啉（hematoporphyrin，HP）及其衍生物因其消除半衰期長達(dá)數(shù)天在體內(nèi)代謝緩慢，延長了皮膚與可見光的光敏反應(yīng)（暗毒性），給治療后的患者生活和工作帶來了極大不便，限制了其在治療PWSs的臨床應(yīng)用。因此，本研究以降低暗毒性并提高治療效果為目的，開發(fā)具有較短半衰期的新型高效低毒PS，以解決HP治療PWSs的不足。
　　金絲桃素(hypericin，HY)為萘駢二蒽酮類化合物，是

3、從貫葉金絲桃中提取的天然活性產(chǎn)物，為一種高效低毒的PS。更重要的是，與HP相比，HY消除半衰期短、代謝快，其可能解決HP因較長半衰期導(dǎo)致的長期暗毒性問題。
　　本研究分別采用羅曼雞雞冠為動物模型、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human UmbilicalVein Endothelial Cells，HUVECs)為體外細(xì)胞模型，研究金絲桃素光動力(HY-PDT)對PWSs動物雞冠模型及體外細(xì)胞模型的光敏作用，并通過與血卟啉光動力(HP-PD

4、T)比較，對其治療效果進(jìn)行評價。同時對HY-PDT的機制進(jìn)行深入探討，為HY替代HP成為治療PWSs的新型高效低毒光敏藥物提供理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下:
　　本研究第一章闡述了HY-PDT治療PWSs的研究背景及目的，為本研究提供理論支持。
　　本研究第二章以羅曼雞雞冠模擬人PWSs，以HP為陽性對照藥，采用HY結(jié)合585 nm黃光照射的PDT治療，對HY-PDT體內(nèi)治療效果及作用機制進(jìn)行了探討。研究結(jié)果顯示，與HP-PD

5、T相比，HY-PDT對PWSs雞冠模型中擴張的真皮層毛細(xì)血管具有較HP-PDT更顯著的損傷作用，即HY-PDT對PWSs雞冠模型具更顯著的治療作用。HY-PDT可損傷線粒體功能及促進(jìn)cyto c釋放，進(jìn)一步提示HY-PDT可激活內(nèi)源性線粒體依賴的細(xì)胞凋亡通路，可能是HY-PDT對PWSs雞冠模型產(chǎn)生治療作用的機制之一。
　　本研究第三章以HUVECs為PWs體外模型，以HP為陽性對照藥，采用HY結(jié)合585 nm黃光照射的PDT治療

6、，檢測HY-PDT對HUVECs細(xì)胞活性、遷移及管腔形成的影響。首先，通過MTT實驗證實了，HY-PDT對HUVECs細(xì)胞活性具有顯著抑制作用，并通過鏡下觀察細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)，顯示治療后細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)特征。此外，劃痕及Matrigel體外成管實驗顯示，HY-PDT能呈濃度依賴性地抑制HUVECs細(xì)胞遷移及管腔形成，且在較低濃度下表現(xiàn)出比HP-PDT更強的抑制作用。
　　本研究第四章對HY-PDT作用機制展開了進(jìn)一步的探討

7、。采用流式細(xì)胞術(shù)、ELISAs、western blot、qRT-PCR等多種細(xì)胞及分子生物學(xué)技術(shù)，測定細(xì)胞、蛋白及RNA變化情況，結(jié)果顯示HY-PDT能顯著抑制HUVECs細(xì)胞活性且高效介導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡。通過測定細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量，TNF-a、IFN-γ及IL-6炎性因子的表達(dá)水平，線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，△Ψm)變化，Bax/Bcl-2、caspase等凋亡相關(guān)蛋白及V

8、EGF-A、Akt、p-Akt及Bad蛋白表達(dá)水平，證實HY-PDT可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞壞死及炎性反應(yīng)的激活。HY-PDT一方面可活化Bax/Bcl-2蛋白活性，直接激活線粒體介導(dǎo)的caspase通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡;另一方面可通過抑制VEGF-A的表達(dá)抑制Akt的磷酸化并促進(jìn)下游Bad的脫磷酸化，可間接激活線粒體介導(dǎo)的caspase通路，提示HY-PDT可通過抑制VEGF-A/PI3K/Akt通路（血管生成通路）VEGF-A/PI

9、3K/Akt(vascular endothelial growth factor-A/ phosphatidylinositol3kinase/protein kinase B，VEGF-A/PI3K/Akt)，間接激活線粒體caspase級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果進(jìn)一步提示HY-PDT抑制血管生成的機制，可能是通過直接激活線粒體介導(dǎo)的caspase通路及抑制VEGF-A/PI3K/Akt通路兩種途徑介導(dǎo)HUVECs細(xì)

10、胞凋亡，即誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是其抑制血管生成的機制之一。
　　本研究分別以羅曼雞雞冠為PWSs動物模型、HUVECs為PWSs體外細(xì)胞模型，以HP為陽性對照藥，采用HY結(jié)合585 nm黃光照射的PDT治療，研究了HY-PDT對PWSs治療作用及機制，證實了HY-PDT可通過激活內(nèi)源性線粒體依賴通路以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡對PWSs雞冠模型擴張的真皮層毛細(xì)血管產(chǎn)生較HP-PDT更顯著的治療作用。其次，在PWSs的體外細(xì)胞模型HUVECs中，HY

11、-PDT可通過抑制細(xì)胞增殖、遷移及管腔的形成以抑制血管形成，且抑制作用顯著強于HP-PDT。再次，HY-PDT可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞壞死及炎性反應(yīng)的激活;HY-PDT可激活線粒體介導(dǎo)的caspase通路及抑制VEGF-A/PI3K/Akt通路，提示HY-PDT誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞凋亡及抑制VEGF-A/PI3K/Akt通路可能是HY-PDT抑制血管生成的機制之一。綜上結(jié)果顯示，HY-PDT可通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞