Argonaute2蛋白與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病關(guān)系的研究.pdf

1、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)的病理生理變化為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acutecoronary syndrome，ACS)是CAD中的危重類型。大量研究發(fā)現(xiàn)，斑塊破裂、血栓形成和短時(shí)間內(nèi)的迅速增大與急性心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。因此，對(duì)于AS斑塊穩(wěn)定性及ACS風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究逐漸成為熱點(diǎn)。
　　斑塊纖維帽完整性和其對(duì)抗破裂的能力主

2、要依賴于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，其中最主要的是膠原纖維，主要包括Ⅰ/Ⅲ型，斑塊內(nèi)膠原合成減少或降解增加均可導(dǎo)致斑塊纖維帽變薄，因而導(dǎo)致斑塊易損性。脯氨酰4-羥化酶(P4H)是膠原合成中的關(guān)鍵酶，其中α為限速亞單位。研究證實(shí)，腫瘤壞死因子(tumor necrosisfactorα，TNFα)可抑制人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞P4Hα1合成，從而引起膠原合成減少。P4Hα1在穩(wěn)定成熟斑塊的同時(shí)，也可加速早期斑塊的形成。Argonaute(AGO)蛋白

3、家族穩(wěn)定存在于大多數(shù)生物體內(nèi)。在目前已知的Ago1、Ago2、Ago3、Ago4四種亞型中，Ago2蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencingcomplex，RISC)的重要成分。Ago2蛋白可與不同的成熟小RNA，包括miRNAs與siRNAs結(jié)合，通過降低靶mRNA穩(wěn)定性或抑制蛋白翻譯過程，來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。在人體外周血中，Ago2作為循環(huán)miRNAs的重要載體，可以避免循環(huán)miRNAs被RNA

4、酶降解。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的冠心病相關(guān)的循環(huán)及血管壁內(nèi)表達(dá)miRNAs有十幾個(gè)，而Ago2與冠心病的相關(guān)性未見報(bào)道。
　　近期研究發(fā)現(xiàn)，在293ET細(xì)胞及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，P4Hα1可以通過羥化Ago2 proline700，提高Ago2的穩(wěn)定性與其核酸內(nèi)切酶活性，增加miRNAs表達(dá)。而在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)中P4Hα1與Ago2的相關(guān)性及Ago2是否參與P4Hα1介導(dǎo)的TNFα對(duì)膠原的調(diào)控尚未見報(bào)道。另外，對(duì)于

5、不同病變程度冠心病患者外周血中，P4Hα1與Ago2的周期性改變及與ACS病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性也亟待研究。
　　目的:
　　1、研究人血漿Ago2及P4Hα1水平與ACS病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性。
　　2、研究人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中P4Hα1對(duì)Ago2的調(diào)控及對(duì)TNFα調(diào)控膠原合成的影響。
　　方法:
　　1、人體研究
　　1.1 收集2015.7.21-2015.11.23于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院住院的不穩(wěn)定心

6、絞痛(UA)、急性心肌梗死(AMI)患者及體檢中心人群各22例。采集患者信息，包括年齡、性別、血壓、血肌酐、血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C及冠脈造影結(jié)果，均進(jìn)行GRACE風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及冠脈Gensini評(píng)分。
　　1.2 收集上述患者血樣，其中MI組分別采集急性心梗24h內(nèi)及7天后的血液樣本，共獲得88份血液樣本。用Elisa測(cè)定患者血漿中P4Hα1及Ago2的濃度。
　　2、細(xì)胞研究
　　2.1 培養(yǎng)人主動(dòng)脈平

7、滑肌細(xì)胞(HASMCs)，選擇8-10代狀態(tài)良好用于實(shí)驗(yàn)。分別設(shè)置P4Hα1慢病毒過表達(dá)(Lenti-P4Hα1)組、P4Hα1 siRNA組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。收集總蛋白，采用western blot檢測(cè)P4Hα1及Ago2蛋白表達(dá)。
　　2.2 培養(yǎng)HASMCs，選擇8-10代狀態(tài)良好用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)置Ago2 siRNA組及空白組，分別給予Lenti-P4Hα1轉(zhuǎn)染。收集總蛋白，采用western blot檢測(cè)P4Hα1、

8、Ago2及CollagenⅢ蛋白表達(dá)。
　　2.3 培養(yǎng)HASMCs，選擇8-10代狀態(tài)良好用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)置Lenti-P4Hα1組及空白對(duì)照組，分別給予TNFα刺激。收集總蛋白，采用western blot檢測(cè)P4Hα1、Ago2及CollagenⅢ蛋白表達(dá)。
　　2.4 培養(yǎng)HASMCs，選擇8-10代狀態(tài)良好用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)置Ago2 siRNA組及空白對(duì)照組，分別給予TNFα刺激。收集總蛋白，采用western blot檢

9、測(cè)P4Hα1、Ago2及CollagenⅢ蛋白表達(dá)。
　　3、統(tǒng)計(jì)分析
　　以上獲得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用IBM SPSS23進(jìn)行。兩組數(shù)值變量間比較采用獨(dú)立樣本及配對(duì)t檢驗(yàn);多組數(shù)值變量間比較采用單因素方差分析(analysis ofvariance，ANOVA)及直線相關(guān)分析，|r|＜0.4為低度相關(guān)，0.4≤|r|＜0.7為中度相關(guān)，|r|≥0.7為高度相關(guān)，顯著性水平（P值）＜0.05視為有效統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;靈敏度及特異度分析采

10、用經(jīng)驗(yàn)ROC曲線。
　　結(jié)果:
　　1、臨床研究結(jié)果:
　　1.1 根據(jù)臨床類型分組，患者基本信息的組間比較
　　88份樣本年齡、性別、收縮壓、肌酐無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05); AMI組與UA組TG、TC、LDL-C、HDL-C無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　1.2 血漿Ago2及P4Hα1濃度的Elisa檢測(cè)結(jié)果及相關(guān)性分析
　　(1)經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)Ago2濃度符合

11、正態(tài)分布(P=0.200，＞0.05)。在本研究群體中，Ago2濃度平均值為0.4085±0.008ng/mL，中位數(shù)為0.4089ng/mL，全距為0.03ng/mL，四分位數(shù)間距為0.01ng/mL。
　　(2)采用Pearson直線相關(guān)分析，血漿P4Hα1水平與Ago2呈顯著正相關(guān)(r=0.876，p＜0.01)。
　　1.3 根據(jù)臨床類型分組，血漿Ago2及P4Hα1濃度的組間比較
　　(1)血漿Ago2水平，

12、AMI組明顯高于UA組及對(duì)照組(p＜0.01); UA組高于對(duì)照組(p＜0.01); AMI組內(nèi)，24h組和7天后測(cè)量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　(2)血漿P4Hα1水平，AMI組明顯高于UA組及對(duì)照組(p＜0.01); UA組高于對(duì)照組(p＜0.01); AMI組內(nèi)，24h組高于7天后測(cè)量組(p＜0.01)。
　　1.4 血漿Ago2水平與ACS危險(xiǎn)程度的相關(guān)性分析
　　采用Spearman直線相關(guān)分析，A

13、go2與GRACE危險(xiǎn)分層評(píng)分呈顯著正相關(guān)（r=0.547，p＜0.01）。
　　1.5 血漿Ago2水平與冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析
　　采用Spearman、Kendall直線相關(guān)分析，Ago2與冠脈Gensini評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(p＞0.05)。
　　1.6 血漿Ago2水平與ACS血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性分析
　　采用Spearman直線相關(guān)分析，Ago2與CK呈顯著正相關(guān)（r=0.451，p＜0.01）;

14、Ago2與CK-MB呈顯著正相關(guān)（r=0.441，p＜0.01）;Ago2與LDH呈顯著正相關(guān)(r=0.575，p＜0.01); Ago2與cTnI呈顯著正相關(guān)(r=0.592，p＜0.01); Ago2與NT-proBNP呈顯著正相關(guān)（r=0.782，p＜0.01）。
　　1.7 血漿Ago2對(duì)于AMI診斷的特異性及敏感性分析
　　采用ROC曲線，曲線下面積為A=0.869，Ago2對(duì)于AMI診斷，敏感性為77.3％，特異

15、性為86.4％，臨界值為0.4135ng/ml。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　2.1 Western blot顯示HASMCs中，抑制P4Hα1能夠下調(diào)Ago2蛋白(p＜0.01)，而過表達(dá)P4Hα1能夠上調(diào)Ago2蛋白表達(dá)(p＜0.05)
　　2.2 Western blot顯示HASMCs中，過表達(dá)P4Hα1后，Ago2 siRNA組的collagenⅢ與Ago2（-）組相比明顯下調(diào)(p＜0.01)
　　2.

16、3 Western blot顯示HASMCs中，過表達(dá)P4Hα1后，TNFα刺激24h組較空白對(duì)照組的P4Hα1、Ago2及Col lagenⅢ明顯下調(diào)(p＜0.01)
　　2.4 Western blot顯示HASMCs中，抑制Ago2后，TNFα刺激24h組較單純TNFα刺激組的Ago2及Co ll agenⅢ蛋白明顯下調(diào)(p＜0.05)，P4Hα1蛋白無(wú)明顯改變。
　　結(jié)論:
　　1、ACS患者血漿中Ago2及P