人甲狀旁腺素在甲醇畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、甲狀旁腺素是由甲狀旁腺分泌的含有84個(gè)氨基酸的直鏈肽,是調(diào)節(jié)體液鈣磷代謝的主要激素.人甲狀旁腺素的主要生理作用是通過調(diào)節(jié)骨細(xì)胞及腎細(xì)胞的功能來(lái)維持血鈣平衡,臨床上可治療骨質(zhì)疏松癥.甲狀旁腺素作為新型轉(zhuǎn)基因藥物在治療骨質(zhì)疏松癥方面具有普通補(bǔ)鈣藥物不可比擬的作用,具有廣泛的市場(chǎng)前景.該論文概述了甲狀旁腺素在國(guó)內(nèi)外的研究情況,并介紹了近年來(lái)發(fā)展較快的真核表達(dá)系統(tǒng)-甲醇畢赤酵母系統(tǒng),來(lái)論證構(gòu)建重組人甲狀旁腺素酵母表達(dá)體系的重要性.該研究通過構(gòu)建

2、重組人甲狀旁腺素表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)入甲醇畢赤酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).論文選用酵母偏愛的密碼子,人工合成長(zhǎng)度為282bp的人甲狀旁腺素(hPTH)基因.將合成的基因克隆于M13載體上,DNA測(cè)序驗(yàn)證正確.根據(jù)資料設(shè)計(jì)PTH的引物,進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增出目的基因片段PTH,將其分離純化后,與表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K重組并轉(zhuǎn)化E.coliTop10F,對(duì)重組子進(jìn)行篩選鑒定.分泌表達(dá)載體的構(gòu)建完成之后,將含目的基因的表達(dá)載體線形化,并電轉(zhuǎn)化到畢赤氏酵母中

3、.應(yīng)用His<'+>表型和G418抗性來(lái)篩選含多拷貝插入的重組子,進(jìn)行重組子的Mut<'+>和Mut<'s>表型鑒定,得到含編碼hPTH基因的構(gòu)建菌.初步研究重組子的誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè),在9.3kDa處有明顯的誘導(dǎo)蛋白帶,與設(shè)計(jì)的目的蛋白的分子量相近,同時(shí)通過酶聯(lián)免疫沉淀法檢測(cè)(ELISA)72hr誘導(dǎo)的上清液具有0.132ng/ml的免疫學(xué)活性,表明成功地構(gòu)建了含甲狀旁腺素基因的畢赤氏酵母