核苷類似物干預(yù)下慢性乙型肝炎患者臨床療效及HBV變異與進(jìn)化規(guī)律的研究.pdf

1、慢性乙型肝炎（CHB）威脅全球人類健康，其中1/3 以上的慢性感染者在中國。
　　 抗病毒治療是慢性乙型肝炎的核心治療措施。核苷類似物（NUC）是目前抗病毒治療的主流藥物。同時(shí)，核苷類似物在使用過程中遇到一系列難以回答的問題，例如：核苷類似物耐藥的預(yù)防和處理；耐藥出現(xiàn)后挽救治療方案如何選擇（聯(lián)合或是序貫）；停藥時(shí)機(jī)的把握等。我們注意到，核苷類似物的耐藥問題是上述問題的核心。目前核苷類似物的使用也主要把握兩點(diǎn)：一是充分發(fā)揮藥物的抗

2、病毒功效，另一方面則是盡量避免耐藥的發(fā)生。然而目前臨床使用核苷類抗病毒藥物缺乏必要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，同時(shí)對治療過程中病毒變異及進(jìn)化模式和耐藥發(fā)生機(jī)制尚未闡明，這是制約核苷類似物科學(xué)合理應(yīng)用的關(guān)鍵問題。
　　 對已經(jīng)處于慢性HBV 感染的大量人群，尤其是已逐漸進(jìn)入免疫清除期即發(fā)病階段的患者，以持久的抑制HBV 復(fù)制為首要目標(biāo)的核苷類似物（NUCs）治療成為臨床治療的主要手段。通過大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)證實(shí)，NUCs 可以顯著減緩和防止乙型肝

3、炎進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌，從而成為目前的主流療法并廣泛使用。大范圍NUCs的干預(yù)改變了患者體內(nèi)HBV的多樣性、進(jìn)化速率及演變方向。病毒在藥物壓力下形成耐藥株，耐藥株的流行及傳播將會(huì)對乙型肝炎的流行和防治產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。核苷類似物對于病毒而言是一種新的環(huán)境，在藥物作用壓力下HBV 逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（RT 區(qū)）
　　 整體上進(jìn)化規(guī)律如何？RT 區(qū)是否受到藥物正選擇壓力的作用？我國CHB人群主要為基因B 型及C 型，核苷類似物療法對于

4、這兩種不同基因型的選擇壓力是否有所不同？
　　 這些問題目前尚缺乏大樣本的研究。
　　 已有的關(guān)于NUCs 耐藥的研究大多數(shù)集中在RT 區(qū)A 至D 結(jié)構(gòu)域內(nèi)，目前常規(guī)使用的幾種NUCs的耐藥位點(diǎn)都已比較明確。HBV基因組50％的基因組為重疊編碼區(qū)，RT 區(qū)核苷酸位點(diǎn)的突變同樣可以導(dǎo)致表面抗原S 區(qū)編碼氨基酸的改變。由于HBV是以全長序列為遺傳單位進(jìn)行復(fù)制和傳播，同時(shí)也受到宿主免疫及藥物壓力的選擇。宿主免疫壓力主要選擇位點(diǎn)

5、為S 區(qū)和C 區(qū)，而NUCs 則主要為RT 區(qū)。因此，NUCs 選擇株的變異必然是全基因組范圍并且相互關(guān)聯(lián)的?；诖?，對NUCs 治療過程中HBV其他編碼區(qū)（尤其是免疫原性較強(qiáng)的C 區(qū)和S 區(qū)）的動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測對于認(rèn)識(shí)NUCs耐藥相關(guān)的肝炎突發(fā)的機(jī)制具有重要意義。同時(shí)，由于HBV 具有準(zhǔn)種特性，宿主免疫和抗病毒藥物的作用可能使得該群體中出現(xiàn)對選擇壓力具有生存優(yōu)勢的變異株，因此闡明HBV 準(zhǔn)種的變異和進(jìn)化模式對于CHB的治療和管理具有指導(dǎo)

6、價(jià)值。以往有許多的針對NUCs 治療患者HBV RT 區(qū)進(jìn)行的準(zhǔn)種方面的研究。然而這些研究均只關(guān)注了NUCs作用的靶區(qū)域即RT 區(qū)，而沒有對HBV 全長進(jìn)行研究。而新近的對HBV 全基因組序列的研究均采用的是PCR 直接測序法擴(kuò)增HBV 全長序列，或通過幾個(gè)擴(kuò)增片段拼接得到全長序列，而沒有采用克隆的方法。因此，NUCs 干預(yù)下HBV 準(zhǔn)種全長序列變異及進(jìn)化模式目前仍未明確。
　　 為探討上述問題，本研究收集了212例LAM 耐藥

7、而后加用ADV 治療的患者，對不同基因型患者LAM 耐藥變異模式的差異以及ADV+LAM 聯(lián)合療法對于不同類型LAM 耐藥人群的療效進(jìn)行了分析。在大樣本（1033例）的接受核苷類似物治療的患者，采用PCR-直接測序法得到HBV RT 區(qū)基因序列，進(jìn)行RT 區(qū)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，利用基于最大似然法的密碼子替換模型分別在基因B 型及C 型序列中檢測其可能的正選擇作用位點(diǎn)以及差異性位點(diǎn)，以期從整體進(jìn)化的角度分析RT 區(qū)基因的進(jìn)化特征。

8、　　 同時(shí)為探索NUCs 干預(yù)下HBV 準(zhǔn)種全長序列變異及進(jìn)化模式，我們納入了5例核苷類似物序貫/聯(lián)合治療的患者以及2例未經(jīng)治療但有肝炎發(fā)作的患者，采用PCR-克隆測序-種系進(jìn)化分析方法，對隨訪過程中的系列血清進(jìn)行了HBV 準(zhǔn)種全長序列變異及進(jìn)化規(guī)律的分析。
　　 主要結(jié)果：
　　 一、基因C型患者發(fā)生LAM突破的時(shí)限長于B型患者（P=0.036）。LAM+ADV聯(lián)合治療3個(gè)月后，所有患者平均HBV DNA水平較LAM

9、突破時(shí)顯著下降（P<0.001）。180例（84.9％）患者ALT復(fù)常，15例（11.6％）患者出現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)。基因B、C型患者聯(lián)合治療后HBV DNA水平、ALT復(fù)常率、HBeAg陰轉(zhuǎn)率無明顯差異。
　　 二、212例患者中共計(jì)193例檢測出rt204位點(diǎn)變異。L180M與M204V聯(lián)合變異的頻率顯著高于M204I（76/80vs. 28/113，P<0.001）。C型患者檢出M204I+L180M變異的頻率高于B型患者（

10、P=0.002），而M204V/I+V207L 變異則在B型患者中比例更高（P=0.005）。M204V+L180M、M204V/I+229及M204V/I+S213T變異在基因B、C型患者中的分布無明顯差異。42例（19.8％）患者出現(xiàn)多位點(diǎn)（3個(gè)及以上位點(diǎn)）耐藥變異。
　　 三、M204V/I 變異聯(lián)合及未聯(lián)合rt180、rt229、rt213 位點(diǎn)變異組在LAM 治療基線、LAM 突破及聯(lián)合治療后的HBV DNA水平、AL

11、T水平及復(fù)常率上均無明顯差異。M204V/I 未合并V207L 變異組聯(lián)合治療后ALT 復(fù)常率高于M204V/I 合并V207L 變異組（P=0.001），而HBV DNA水平無明顯差異。
　　 四、基因B 型RT 區(qū)序列平均非同義（Dn）/同義突變率（Ds）比值ω=0.26，正選擇位點(diǎn)為rt204 位及rt222 位氨基酸?；駽 型RT 區(qū)序列平均ω=0.19，正選擇位點(diǎn)為rt180位及rt204 位氨基酸。
　　

12、五、基因B 型及C 型RT 區(qū)序列有六個(gè)位點(diǎn)存在選擇壓力的差異，分別為：rt182（P=0.08）、rt209（P=0.09）、rt211（P<0.001）、rt226（P=0.04）、rt235（P=0.08）以及rt238（P=0.02）。
　　 六、3例LAM 初治耐藥而后換用其他NUCs 治療的患者HBV 全基因組核苷酸及各編碼區(qū)氨基酸異質(zhì)性在出現(xiàn)LAM 病毒學(xué)突破時(shí)均降至最低點(diǎn)，而在拯救治療后又重新增高。接受ADV-替

13、比夫定（LDT）序貫治療的兩例患者基因組異質(zhì)性的變化則各有其特點(diǎn)。
　　 七、2例未治療組患者在出現(xiàn)肝炎突發(fā)時(shí)核苷酸及氨基酸異質(zhì)性均較無癥狀期升高。
　　 八、HBV基因組各編碼區(qū)在慢性化感染過程中的遺傳異質(zhì)性的變化趨勢各不相同，不同的患者也各有其特征。
　　 九、5例經(jīng)NUCs 治療的患者均檢測出NUC 相關(guān)耐藥位點(diǎn)變異，3例患者出現(xiàn)多藥（重）耐藥。所有患者治療前“a”決定簇均未檢測出氨基酸改變，而在治療后4例

14、患者在該區(qū)出現(xiàn)了編碼氨基酸的改變。未治療的兩例患者大多數(shù)的變異均集中位于前C/C 區(qū)。
　　 十、5例治療組患者在前S/S 區(qū)或C 區(qū)的T細(xì)胞或B細(xì)胞表位中均出現(xiàn)了伴隨RT區(qū)變異的編碼氨基酸的改變。部分患者在核心啟動(dòng)子區(qū)及前C 區(qū)等也檢測到伴隨RT區(qū)變異的核苷酸突變。
　　 通過對這些結(jié)果進(jìn)行分析并和既往研究結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)論如下：
　　 一、LAM+ADV聯(lián)合療法對于不同基因型（B型及C型）及不同LAM變異類型

15、的耐藥患者均能夠取得較好的療效。
　　 二、基因B型及C型患者LAM補(bǔ)償耐藥位點(diǎn)（L180M及V207L）的分布有一定的差異。LAM初始單藥治療的患者中有一部分可能出現(xiàn)多位點(diǎn)耐藥變異，提示對這部分患者初始抗病毒治療應(yīng)選擇高基因屏障的藥物。
　　 三、通過大樣本HBV RT區(qū)基因序列的進(jìn)化分析，證實(shí)在NUCs干預(yù)下RT區(qū)基因整體上以凈化選擇的模式為主，少數(shù)位點(diǎn)則呈現(xiàn)為正選擇的進(jìn)化模式?；駼型及C型RT區(qū)基因在部分非NUC

16、耐藥變異位點(diǎn)上所受到的選擇壓力有所不同。
　　 四、不同NUC藥物治療方式對HBV全基因組準(zhǔn)種的進(jìn)化方式有影響：采用LAM初治患者在LAM耐藥時(shí)病毒異質(zhì)性降低，而在挽救治療之后異質(zhì)性又逐漸升高；而ADV突破后換用其他NUC治療的患者HBV準(zhǔn)種則具有不同的進(jìn)化規(guī)律。
　　 五、經(jīng)NUCs治療的患者與未治療但出現(xiàn)肝炎突發(fā)的患者HBV準(zhǔn)種具有不同的進(jìn)化及變異模式：未治療患者在肝炎突發(fā)時(shí)HBV基因組變化主要集中在前C/C區(qū)，而在