馬鈴薯S病毒外殼蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備.pdf

1、本研究的目的是構(gòu)建馬鈴薯S病毒(PVS)外殼蛋白(CP)基因的原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)，用表達(dá)產(chǎn)物作抗原制備抗血清，進(jìn)一步獲得純化的抗體(IgG)與酶標(biāo)記抗體并用于PVS的DAS-ELISA檢測(cè)，為組裝PVS的ELISA檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。 以質(zhì)粒pGEM-pvs為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲到了長(zhǎng)約890bp的PVS～CP基因條帶。用Ultrafree-DA試劑盒一步離心法回收特異性DNA片段并與T表達(dá)載體pBAD/Thio-TO

2、PO連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌TOPO10獲得了Amp抗性菌落。經(jīng)質(zhì)粒電泳檢測(cè)、PstⅠ與SphⅠ的單酶切和雙酶切鑒定，篩選到了PVS-CP基因正向插入載體的陽(yáng)性克隆，相應(yīng)的重組質(zhì)粒命名為pBAD-SCP。DNA測(cè)序結(jié)果表明882bp的不含終止密碼的PVS-CP基因序列插入載體的方向正確、密碼子的閱讀正確，即成功構(gòu)建了PVS-CP基因的原核表達(dá)載體。 用阿拉伯糖誘導(dǎo)工程菌TOPO10(pBAD-SCP)中外源基因的表達(dá)，獲得了預(yù)期的

3、49kDa融合蛋白。誘導(dǎo)研究表明在SOB培養(yǎng)基中融合蛋白的表達(dá)量高于LB培養(yǎng)基，經(jīng)優(yōu)化的表達(dá)條件為：37℃，在SOB培養(yǎng)基中用0.2％阿拉伯糖誘導(dǎo)4h。光密度掃描結(jié)果表明該融合蛋白在細(xì)菌總蛋白中占的比例為27％。 用溶菌酶裂解菌體，提取細(xì)菌總蛋白，SDS-PAGE顯示表達(dá)的融合蛋白主要以包涵體的形式存在。用8M尿素溶解包涵體，經(jīng)鎳離子親和層析純化，獲得了高純度的目的蛋白。對(duì)純化后的變性蛋白進(jìn)行了透析復(fù)性與柱上復(fù)性處理，獲得了兩種

4、復(fù)性蛋白。 分別用純化得到的變性蛋白、透析復(fù)性獲得的蛋白與柱上復(fù)性獲得的蛋白作抗原免疫家兔，制備出了抗血清。瓊脂糖雙向擴(kuò)散顯示三種抗血清與抗原(融合蛋白)均能形成明顯的沉淀線，即獲得了該蛋白的特異性抗血清，用變性蛋白制備的抗血清的效價(jià)為1：16，其余兩種為1：32。間接ElISA測(cè)定表明復(fù)性蛋白抗血清的效價(jià)分別為1：12800和1：6400，而變性蛋白抗血清的效價(jià)為1：1600。兩種測(cè)定方法的結(jié)果都表明復(fù)性蛋白抗血清的效價(jià)高于變

5、性蛋白的抗血清。 先用飽和(NH<,4>)<,2>SO<,4>進(jìn)行鹽析，然后用Protein G親和層析柱純化，獲得了高純度抗體(IgG)。用戊二醛一步法對(duì)純化的抗體進(jìn)行標(biāo)記，獲得了IgG的堿性磷酸酶標(biāo)記物。用純化的IgG與酶標(biāo)抗體(IgG-AP)對(duì)感染PVS的幼苗進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)，結(jié)果呈陽(yáng)性，健康的幼苗則呈陰性，結(jié)果表明獲得了PVS的特異性多克隆抗體與酶標(biāo)記抗體。 本研究為通過(guò)基因工程途徑大量制備PVS抗體、