免疫抑制劑影響凋亡細(xì)胞免疫耐受誘導(dǎo)作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景: 器官移植是終末期器官功能衰竭的重要治療手段，移植排斥反應(yīng)是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素。理論上，誘導(dǎo)針對(duì)移植抗原的特異性免疫耐受是防治移植排斥反應(yīng)的最佳途徑，其優(yōu)點(diǎn)是：明顯提高移植術(shù)成功率；避免免疫抑制劑所致的毒副作用和繼發(fā)感染；降低醫(yī)療耗費(fèi)。因此，誘導(dǎo)移植耐受成為移植免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。移植免疫耐受是機(jī)體免疫系統(tǒng)在接觸某種移植物后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不損害移植物。誘導(dǎo)移植免疫耐受的前提是：①使受者免疫系統(tǒng)接觸供者移植抗原；②對(duì)受者免疫系統(tǒng)進(jìn)

2、行調(diào)控，使其耐受供者抗原。目前誘導(dǎo)移植耐受的方法主要有：1）阻斷協(xié)同刺激信號(hào)通路；2）T細(xì)胞清除：即清除周圍和中樞淋巴組織的淋巴細(xì)胞；3）混合性嵌合體建立，等等。但是這些方法都有很大的局限性。本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)一直研究凋亡細(xì)胞與免疫耐受，提出“供者凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)免疫耐受”理論。 細(xì)胞凋亡是一種基本生命現(xiàn)象，是細(xì)胞循自身程序結(jié)束其生命的主動(dòng)死亡的過程。細(xì)胞凋亡廣泛參與機(jī)體病理生理過程，并在自身免疫病、病毒感染、腫瘤和肝臟免疫中起重要

3、作用。近10年來(lái)，凋亡細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用受到高度關(guān)注?，F(xiàn)已證明，凋亡細(xì)胞可誘導(dǎo)移植免疫耐受，但其機(jī)制尚未完全闡明。目前推測(cè)以下機(jī)制起重要作用：1）抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）可快速攝取凋亡細(xì)胞：巨噬細(xì)胞（Mφ）或樹突狀細(xì)胞（DC）表面表達(dá)某些特異性受體，可通過識(shí)別凋亡細(xì)胞所攜帶相應(yīng)抗原而快速攝取凋亡細(xì)胞。吞噬凋亡細(xì)胞后，吞噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路被阻斷，抑制促炎因子的產(chǎn)生，同時(shí)阻斷

4、IL-12、Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17、IL-23的釋放；2）APC可更有效地提呈凋亡細(xì)胞所攜帶的供者抗原：由于凋亡細(xì)胞表達(dá)特異性吞噬信號(hào)“eatmesignal”，使其所攜帶的供者抗原被特異性地濃集于受者APC內(nèi)，因而能在短時(shí)間內(nèi)提供大量供者M(jìn)HC抗原，故能更有效地被受者APC提呈給T細(xì)胞；3）凋亡細(xì)胞抑制DC成熟。由于未成熟DC表面表達(dá)的分子如MHCⅠ、MHCⅡ、CD86及其它黏附分子水平低下，因而未成熟DC在向T細(xì)胞提呈抗原時(shí)

5、不能提供充分的共刺激信號(hào)，從而可以誘導(dǎo)免疫耐受；4）凋亡的中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞可能隔離趨化因子以阻止炎性細(xì)胞的募集；細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑、橋接凋亡細(xì)胞與吞噬細(xì)胞的可溶性因子、介導(dǎo)凋亡細(xì)胞被吞噬的配受體等都參與凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的過程；5）局部微環(huán)境的作用：凋亡細(xì)胞被APC攝取后，可調(diào)節(jié)APC功能、促使APC分泌免疫抑制因子并誘生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 機(jī)體通過多種復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制維持免疫自穩(wěn)，預(yù)防自身免疫的發(fā)生和調(diào)節(jié)病原體及環(huán)境因素引起的炎癥反

6、應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）在不同的機(jī)制中起主要作用，是外周耐受主要的調(diào)節(jié)因素。CD4+CD25highT細(xì)胞亞群具有免疫調(diào)節(jié)功能，是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的主要類型。 最近幾年，關(guān)于Treg調(diào)節(jié)免疫抑制的作用分子和機(jī)制被廣泛研究，并取得了重要進(jìn)展。關(guān)于Treg的免疫調(diào)控機(jī)制主要有四種“作用方式”：抑制性因子的抑制作用；細(xì)胞溶解的抑制作用；代謝崩潰的抑制作用；通過調(diào)節(jié)DC成熟或功能的抑制作用。

7、 環(huán)孢霉素A（Cyclosporin A，CsA）和雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）是器官移植術(shù)后預(yù)防排斥反應(yīng)的常用藥。免疫抑制劑減少免疫細(xì)胞的增殖和活化，進(jìn)而抑制移植排斥反應(yīng)，其分子機(jī)制是：CsA主要與嗜環(huán)蛋白（cyclophilin）形成復(fù)合物，抑制鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin）的活化，阻礙NFAT的去磷酸化與核轉(zhuǎn)位，從而阻斷IL-2的轉(zhuǎn)錄和T細(xì)胞的活化。Rapa則與FKBP12結(jié)合形成Rapa-FKBP12復(fù)合

8、物，后者作用于靶蛋白mTOR（mammalian target of rapamycin，mTOR），抑制mTOR的作用，阻斷T淋巴細(xì)胞從G1期到S期的進(jìn)程。應(yīng)用免疫抑制藥物可以有效地控制移植排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)器官的存活時(shí)間。 免疫抑制劑已在臨床得到廣泛應(yīng)用，在探討輸注供者凋亡細(xì)胞而誘導(dǎo)移植耐受的臨床應(yīng)用前景時(shí)，須充分考慮免疫抑制劑對(duì)此干預(yù)策略的影響。闡明不同免疫抑制劑對(duì)凋亡細(xì)胞致耐受作用的影響具有重要意義，可為臨床實(shí)踐中聯(lián)合應(yīng)用免

9、疫抑制劑和輸注供者凋亡細(xì)胞聯(lián)合治療提供依據(jù)。所以，為初步探討常用免疫抑制劑是否能促進(jìn)凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成的能力，并研究其可能機(jī)制。設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容，包括三部分： 第一章、凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。 目的：建立誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)方法，探討輸注凋亡細(xì)胞對(duì)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用及可能機(jī)制。 方法：將雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，飼養(yǎng)在SPF級(jí)飼養(yǎng)柜中，飲用水和飼料均

10、經(jīng)滅菌處理。實(shí)驗(yàn)組小鼠靜脈輸注1．0×108個(gè)/ml×200ul小鼠胸腺凋亡細(xì)胞；對(duì)照組小鼠輸注等體積的無(wú)菌PBS液。2周后戊巴比妥腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下經(jīng)眼球采集外周血，肝素抗凝，備用。分離脾臟和胸腺，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，分別加入FITC-CD4單克隆抗體和PE-CD25單克隆抗體后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25highT細(xì)胞。 結(jié)果：輸注凋亡細(xì)胞后胸腺、脾臟和外周血中CD4+CD25highT在CD4+T

11、細(xì)胞的比率分別為0．650±0．073%、、4．340±0．338%，3．848±0．363%；而PBS對(duì)照組的比例為0．376±0．087%、3．426±0．100%、0．952±0．060%、2．762+0．186%，兩者之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。 結(jié)論：凋亡細(xì)胞能誘導(dǎo)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成，從而可以誘導(dǎo)免疫耐受預(yù)防移植排斥的發(fā)生，為“凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)免疫耐受”這一理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第二章、免疫抑制劑對(duì)

12、小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響。 目的：探討免疫抑制劑環(huán)孢素A和雷帕霉素分別對(duì)小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用及機(jī)制。 方法： （1）選擇雄性8周齡C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)平均分為兩組。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射環(huán)孢素A20mg．kg-1．d-1×2周，對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的PBS×2周； （2）選擇雄性8周齡C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)平均分為兩組。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射雷帕霉素1．5mg．kg-1．d-1×2周

13、，對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的PBS×2周； （3）2周后，各組小鼠在無(wú)菌條件下經(jīng)眼球采集外周血，并分離脾臟和胸腺，制備單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。 結(jié)果： 1．CsA處理的小鼠外周血、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞懸液中CD4+Foxp3+T淋巴細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞的比率分別為6．211±0．793%、11．200±0．513%和0．628±0．025%；而在PBS組小鼠外周血、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中分別為1．86

14、0±0．805%、15．360±0．683%和2．122±0．107%，各組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．001）。 2．Rapa處理組C57小鼠外周血、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞CD4+CD25highT細(xì)胞比率在CD4+T細(xì)胞的比率分別為6．280±0．275%、12．930±1．608%、9．880±0．484%，對(duì)照組C57小鼠外周血、脾細(xì)胞和胸腺內(nèi)分別為5．780±0．528%、7．720±0．921%、2．430±0．284%

15、，差異有顯著性（P<0．01）。Rapa顯著減少中樞淋巴器官和外周淋巴器官中CD4+T的數(shù)量，相對(duì)增加CD4+CD25highT細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分比。 結(jié)論： 1、CsA損害調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的發(fā)育，從而減少小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從而降低免疫耐受的誘導(dǎo)作用； 2、Rapa不影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育，而是抑制其它CD4+T淋巴細(xì)胞亞型的發(fā)育，Rapa這種對(duì)CD4+CD25highT細(xì)胞和非CD4+C

16、D25highT細(xì)胞的不同作用將有利于移植患者誘導(dǎo)免疫耐受。 第三章、雷帕霉素對(duì)凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用及機(jī)制。 目的：探討免疫抑制劑雷帕霉素對(duì)凋亡細(xì)胞輸注誘導(dǎo)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成的作用及機(jī)制。 方法：將8周齡的雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)平均分為3組：第一組為凋亡細(xì)胞處理組、第二組為雷帕霉素處理組、第三組為凋亡細(xì)胞與雷帕霉素聯(lián)合處理組。小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)飼養(yǎng)柜中，飲用水和飼料均經(jīng)滅菌處理。第一組小鼠靜脈

17、輸注1．0×108/ml×200ul凋亡細(xì)胞；第二組小鼠腹腔注射雷帕霉素1．5mg．kg-1．d-1×2周；第三組給予靜脈輸注1．0×108/ml×200ul凋亡細(xì)胞，同時(shí)給予腹腔注射雷帕霉素1．5mg．kg-1．d-1×2周。2周后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25highT細(xì)胞。 結(jié)果：經(jīng)凋亡細(xì)胞、雷帕霉素單獨(dú)處理和凋亡細(xì)胞與雷帕霉素聯(lián)合處理2周后，小鼠外周血CD4+CD25highT細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞的比率分別為：8．0

18、00±0．855%、5．540±0．235%、4．040±0．708%；脾臟細(xì)胞中分別為：4．320±0．338%、6．180±0．359%、8．380±0．557%；而胸腺分別為：0．650±0．073%、1．420±0．165%、2．120±0．215%，各組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。 結(jié)論：雷帕霉素與凋亡細(xì)胞在誘導(dǎo)免疫耐受中可能存在協(xié)同作用，可在臨床實(shí)踐中聯(lián)合應(yīng)用雷帕霉素和輸注供者凋亡細(xì)胞有可能預(yù)防及治療移植排