胡蘿卜抗凍蛋白的表達(dá)純化及其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系.pdf

1、抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一類能控制冰晶生長(zhǎng)和抑制冰晶之間發(fā)生重結(jié)晶的蛋白質(zhì),能在結(jié)冰或亞結(jié)冰條件下保護(hù)生物體不受傷害.AFPs具有兩種明顯不同的活性--熱滯(thermal hysteresis,TH)活性和重結(jié)晶抑制(recrystallizationinhibition,RI)活性.植物AFPs的特征是低TH活性高RI活性,雖然這種特性的分子機(jī)理目前還處于探索階段,但與魚(yú)類和昆蟲(chóng)AFPs相比,植

2、物AFPs更適合于植物轉(zhuǎn)化、食品的冷凍保藏和細(xì)胞、組織、器官等的低溫保存.將從中國(guó)胡蘿卜栽培品種中克隆的胡蘿卜抗凍蛋白(DcAFP)的基因在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了高效的表達(dá).通過(guò)優(yōu)化它的表達(dá)條件,確定了一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的純化方法:Native-PAGE純化法,提出了一個(gè)可與TH活性測(cè)定法互為補(bǔ)充的細(xì)菌0℃冷處理法,并成功用來(lái)檢測(cè)重組表達(dá)的DcAFP及其突變體的體外抗凍活性,活性檢測(cè)表明,目的蛋白不僅展示了適度的TH活性,而且還

3、能有效地增強(qiáng)細(xì)菌的抗冷性.通過(guò)同源建模方法獲得了DcAFP的理論三維結(jié)構(gòu).從DcAFP的TH活性發(fā)生變化的系列突變體中,選擇一個(gè)TH活性降低的突變體pC2300-35S-N178V以及兩個(gè)TH活性增強(qiáng)的pC2300-35S-P82N和pC2300-35S-T106N進(jìn)行了轉(zhuǎn)化煙草的研究.由于具有LRR重復(fù)單元的DcAFP屬于PGIP(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)家族,因而通過(guò)酵母雙雜交來(lái)分析DcAFP是否還保留著微弱的PGIP活性.在通過(guò)