蛋白質(zhì)組學和分子生物學在HCMV感染致病機制的應用研究.pdf

1、目的: 1.應用SELDI-TOF-MS技術檢測人巨細胞病毒(HCMV)感染導致臨床個體致肝炎綜合征血清學和HCMV感染相關細胞的神經(jīng)瘤細胞內(nèi)、外液蛋白質(zhì)組學差異表達，建立與HCMV致病相關的蛋白標志物篩選方法； 2.建立可調(diào)控的針對HCMV即刻早期基因的細胞表達系統(tǒng)，并檢測即刻早期基因?qū)毎沟蛲龅挠绊?，以此探討可能的機理。 材料和方法： 1.取臨床HCMV引起的先天性嬰兒肝炎綜合征(Congenita

2、l human cytomegalovirus hepatitis)患兒20例作為實驗組，三個對照組25例血清標本(肝功能情況檢測、CMV特異性IgM抗體及尿CMV基因定量檢測)，分離并制備蛋白，與WCX2蛋白質(zhì)芯片相互作用，利用SEIDI-TOF-MS技術檢測細胞內(nèi)液中分子量在5000-20000Da范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的表達情況，繪制出蛋白飛行質(zhì)譜，在Biomarker Wizard軟件的輔助下，分析差異蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和等電點，在

3、Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫中對差異蛋白進行初步鑒定。 2.選擇人星型膠質(zhì)瘤細胞(U251細胞)和人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)，按細胞數(shù)量之比為10:1的比例將兩種細胞混合培養(yǎng)，感染HCMVAD169株。病毒感染神經(jīng)瘤細胞6h后，RT-PCR的方法檢測HCMV IE基因的表達水平。流式細胞儀檢測，觀察HCMV感染對神經(jīng)瘤細胞凋亡的影響；體外培養(yǎng)U251，細胞，細胞感染病毒后不同時間段收獲細胞為實驗組，同時收獲正常細胞為對照組，使

4、用基于SELDI技術的時間.飛行質(zhì)譜儀和WCX2芯片，檢測各組之間細胞內(nèi)、外液蛋白表達譜的差異。將各組蛋白質(zhì)圖譜進行比較，并將相關蛋白峰在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索，尋找與病毒的感染及發(fā)病相關的蛋白分子。 3.利用已有質(zhì)粒pIE72，設計人巨細胞病毒HCMV即刻早期基因IE1的特異性引物，進行IE1基因的擴增、提純、鑒定，構(gòu)建重組的可調(diào)控真核表達載體pTRE2-hyg/IE1，純化質(zhì)粒。 4.常規(guī)培養(yǎng)Tet-On HeL

5、a細胞，以陽離子高效轉(zhuǎn)染試劑HifectinⅡ轉(zhuǎn)染細胞。首先在培養(yǎng)的HeLa細胞中轉(zhuǎn)染增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)報道基因，在普通熒光顯微鏡下觀察顯示綠色熒光的HeLa細胞，確定轉(zhuǎn)染效率；在轉(zhuǎn)染EGFP基因的基礎上，體外常規(guī)培養(yǎng)Tet-On HeLa細胞，轉(zhuǎn)染pTRE2-hyg/IE1重組質(zhì)粒，經(jīng)G418和潮霉素雙重篩選，RT-PCR和Western Blot和免疫

6、組織化學方法鑒定IE1的表達。 5.終濃度為100ng/mL的腫瘤壞死因子a作用于HeLa細胞，建立HeLa細胞的凋亡曲線；不同終濃度的Doxcycline(0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL)作用轉(zhuǎn)染pTRE2-hyg/IE1的HeLa細胞，誘導IE1表達，RT-PCR方法檢測IE1基因的產(chǎn)生，Western blot檢測IE1蛋白的產(chǎn)生水平，MTT法檢測HeLa細胞的細胞增值率。 結(jié)果： 1.HC

7、MV引起的先天性嬰兒肝炎綜合征組與各對照組比較，血清中有4個蛋白質(zhì)表達水平發(fā)生明顯變化，在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索到分子量為5811.6Da、7935.6Da和8899.3Da的蛋白峰分別與β-防御素8、巨噬細胞源性趨化因子和血小板堿性蛋白在分子量和等電點上非常接近。 2.HCMV感染的兩個組與無HCMV感染的兩組嬰兒比較，血清中共有5個蛋自質(zhì)表達水平發(fā)生明顯變化，其中5639.0Da、5909.6Da、7776.5Da和15

8、833.2Da的蛋白峰分別與促胸腺生成素、β淀粉樣前體蛋白A4、血小板因子4和白細胞介素-25在分子量和等電點上非常接近。 3.HCMV隱性感染組與其他組比較，血清中有2個蛋白質(zhì)表達水平發(fā)生明顯變化，5710.7Da的蛋自峰與β-防御素31非常接近。 4.兩個先天性嬰兒肝炎綜合征組與肝功能正常的另兩組嬰兒比較，血清中有4個蛋白質(zhì)表達水平發(fā)生明顯變化，其中7567.6Da、13744.1Da、15092.8Da、15931

9、.6Da的蛋白峰分別與巨噬細胞炎性蛋白4、前白蛋白、肝再生增強因子和結(jié)合珠蛋白非常接近。 5.RT-PCR的方法檢測HCMV IE基因的表達用于證實HCMV感染，成功建立了神經(jīng)瘤細胞的HCMV感染模型。病毒感染1天后細胞無明顯變化，感染3天后細胞在G1峰左側(cè)出現(xiàn)一個亞二倍體細胞群的峰(亞G1峰，即凋亡峰)，感染5天后細胞凋亡峰明顯。 6.病毒感染后細胞發(fā)生凋亡，且隨病毒感染時間的延長，細胞凋亡明顯增加。感染后3天和6天的

10、細胞凋亡率分別為4.1％和42.6％。與正常對照組比較，分子量為2631.6Da、12027Da和13536.3Da的蛋白峰在病毒感染后表達持續(xù)上調(diào)，HCMV感染后4h略有增高，病毒感染后48h明顯升高。通過在Swiss數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)其蛋白峰的分子量和等電點分別與Caspase-1、TNF-a、β淀粉樣前體蛋白非常接近。 7.構(gòu)建的真核表達載體pTRE2-hyg/IE1序列測定正確。Dox調(diào)控的重組表達載體pTRE2-hyg/

11、IE1體外轉(zhuǎn)染HeLa細胞后，經(jīng)G418和潮霉素B雙重篩選，獲得一株穩(wěn)定表達IE1的HeLa細胞株。梯度濃度的Doxcycline(0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL)作用pTRE2-hyg/IE1-HeLa細胞48h，RT-PCR檢測Dox誘導表達的mRNA比值IE1/β-actin分別為0.733，0.917和1.768，western blot檢測IE1蛋白，IE1/β-actin分別為1.32，5.83和7.07。

12、 8.終濃度為100μg/mL的TNF-a和25μg/mL的ACTD聯(lián)合作用于轉(zhuǎn)染IE1質(zhì)粒的HeLa細胞后，MTT檢測HeLa細胞增值率顯示轉(zhuǎn)染IE1的細胞在8h之內(nèi)細胞活性大于未轉(zhuǎn)染細胞組，caspACE檢測caspase-3表達量分別為0.6±0.029、1.6±0.04.1和1.85±0.065，而未轉(zhuǎn)染IE1的HeLa細胞caspase-3表達量分別為0.85±0.061、2.6±0.058和4.5±0.065。統(tǒng)計學分

13、析各組比值差異有顯著意義(P<0.01)，從而證明轉(zhuǎn)染后的IE1-HeLa細胞具有顯著抗凋亡功能，細胞學觀察也證實這一點。 結(jié)論： 1.建立了HCMV感染引起的先天性嬰兒肝炎綜合征人群的血清蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫和HCMV感染神經(jīng)瘤細胞的細胞內(nèi)、外液差異蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫，并發(fā)現(xiàn)了HCMV臨床個體及細胞學改變的有意義的蛋白質(zhì)組學指標。 2.HCMV感染過程持續(xù)增高的細胞蛋自因子，可能與HCMV感染所產(chǎn)生的細胞凋亡有關。