鯉腦組織低溫差異表達(dá)候選基因的篩選、cDNA全長(zhǎng)克隆及功能預(yù)測(cè).pdf

1、為從基因表達(dá)水平上研究魚類耐低溫機(jī)制，選取東北地區(qū)具有耐低溫性狀的黑龍江鯉(Cyprinuscarpio)為實(shí)驗(yàn)材料，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行基因表達(dá)量差異檢測(cè)。鑒于在溫度發(fā)生變化的過程中，腦部是神經(jīng)中樞，同時(shí)也是參與體溫調(diào)節(jié)的重要組織，其中的基因表達(dá)變化通常是最快、最靈敏的。通過查閱文獻(xiàn)，收集并下載前人報(bào)道的鯉腦組織在低溫下誘導(dǎo)表達(dá)的EST序列50個(gè)，根據(jù)熒光定量RT-PCR的擴(kuò)增特點(diǎn)和要求，設(shè)計(jì)50個(gè)候選基因的引物

2、使其擴(kuò)增片段大小在100～200bp之間。將黑龍江野鯉分別設(shè)23℃常溫對(duì)照組和6℃低溫待測(cè)組，采集鯉腦組織提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨機(jī)挑選2個(gè)模板用普通PCR法對(duì)50對(duì)引物進(jìn)行篩選，結(jié)果有26個(gè)候選基因及內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增條帶清晰、唯一。使用Rotorgene3000定量PCR儀，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，分別以23℃常溫對(duì)照組和6℃低溫待測(cè)組的黑龍江鯉腦組織cDNA為模板，以18SrRNA為內(nèi)參基因，檢測(cè)26個(gè)候選基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)

3、數(shù)據(jù)經(jīng)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，有5個(gè)候選基因在低溫條件下表達(dá)量顯著上升(P<0.01)，與對(duì)照組相比它們的表達(dá)量分別上升了2.11倍、13.9倍、2.52倍、7.38倍和1.83倍，基因功能比對(duì)結(jié)果表明其編碼蛋白產(chǎn)物分別是脂肪酸鏈延伸酶(ELO)，酰基輔酶A脫氫酶(SCD)，轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡB(TFⅡB)，肌醇-1-磷酸合成酶(MIPS：EC5.5.1.4)，血腦屏障HT7抗原(basigin)；有7個(gè)候選基因在低溫下表達(dá)量分別下降了21.8％、

4、25.9％、16.6％、23.7％、15.8％、16.3％、42.5％，但對(duì)照組和待測(cè)組差異不顯著(P>0.05)，基因功能比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們主要參與抑制糖酵解，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和干擾神經(jīng)系統(tǒng)的重塑活動(dòng)。
　　 將鯉魚5個(gè)候選基因的序列在NCBI斑馬魚數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)候選基因均與斑馬魚(Daniorerio)同源，仍以18SrRNA為內(nèi)參基因，檢測(cè)上述4個(gè)候選基因在斑馬魚腦組織中的表達(dá)差異。結(jié)果表明低溫條件下脂

5、肪酸鏈延伸酶、?；o酶A脫氫酶、轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡB、血腦屏障HT7抗原4個(gè)基因的表達(dá)量分別是常溫對(duì)照組的0.76倍，1.62倍，1.36倍和1.05倍，表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。鯉魚及斑馬魚定量結(jié)果充分說(shuō)明上述5個(gè)基因很有可能與魚類耐低溫性狀密切相關(guān)，根據(jù)其各自參與的機(jī)體代謝功能推測(cè)，低溫條件誘導(dǎo)鯉魚某些基因的表達(dá)，通過加強(qiáng)不飽和脂肪酸代謝活動(dòng)，神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活動(dòng)及腦部細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)運(yùn)輸及交換作用，以達(dá)到對(duì)冷環(huán)境的適應(yīng)

6、。
　　 5個(gè)鯉腦組織低溫差異表達(dá)候選基因的獲得為進(jìn)行不耐低溫魚類的基因工程育種提供了基因元件。使用Clontech的SMARTerTMRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒分別擴(kuò)增5個(gè)候選基因的5’及3’端cDNA序列，測(cè)序后利用DNAstar-SeqMan程序拼接出重疊群(contig)序列，去除通用引物序列后得到每個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并向NCBI提交序列信息，獲取登錄號(hào)分別為JF836160、JF836162、JF836163、

7、JF836164、JF836165，cDNA全長(zhǎng)分別為2737bp、2618bp、1555bp、2154bp、1971bp。利用NCBIORFfinder軟件尋找5個(gè)基因的開放性讀碼框(ORF)，讀碼框長(zhǎng)度分別為876bp，975bp，951bp，1659bp，840bp。用DNAstarEditseq軟件將每個(gè)基因的最長(zhǎng)正義鏈相位點(diǎn)ORF翻譯成蛋白質(zhì)序列，5個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度分別為291aa，324aa，316aa，552aa

8、及279aa。使用protparam、protscale、TMHMM、PHD、InterProScan、SWISS-MODEL等軟件預(yù)測(cè)5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明5個(gè)蛋白質(zhì)的功能分別為脂肪酸鏈延伸酶、脂肪酸脫氫酶、轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡB、肌醇-1-磷酸合成酶及Basigin蛋白；蛋白質(zhì)同源建模結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡB及肌醇-1-磷酸的合成酶的同源蛋白三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)有所研究，但對(duì)于脂肪酸延伸酶、脂肪酸脫氫酶及Basi

9、gin蛋白的三維結(jié)構(gòu)還知之甚少。根據(jù)各自的氨基酸序列Blastp結(jié)果，運(yùn)用MEGA4.0軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹，分子進(jìn)化樹結(jié)果表明，鯉魚蛋白質(zhì)進(jìn)化距離與屬冷水魚類的大西洋鮭(salmosalar)及屬溫水性魚類的草魚(Ctenopharyngodonjdellus)最近，而與屬熱帶魚類的斑馬魚、遮目魚(Chanoschanos)稍遠(yuǎn)，說(shuō)明這些蛋白功能與魚類的溫度適應(yīng)性緊密相關(guān)。
　　 為準(zhǔn)備后續(xù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，選取Tol2轉(zhuǎn)座子載體作為