抗菌肽天蠶素A截短肽的高效表達(dá)、分離純化及抗體制備.pdf

1、背景介紹: 近年來(lái)由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致臨床耐藥株日益增多，故尋找新種類抗菌藥成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。自從瑞典科學(xué)家Boman在惜古比天蠶（Hyalophoracecropia）中發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來(lái)，已有幾百種抗菌肽被相繼發(fā)現(xiàn)。抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定、水溶性好、免疫原性較低、作用迅速的特點(diǎn)，不僅可以有效殺滅細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)，部分還有一定抗惡性腫瘤作用，并且不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)真核細(xì)胞毒性作用低等特點(diǎn)，備受關(guān)注。其相應(yīng)的原核

2、、真核、昆蟲(chóng)等表達(dá)體系也被構(gòu)建。但由于其本身的抗菌活性，使其很難在原核細(xì)胞的工程菌中表達(dá)，而真核等系統(tǒng)的表達(dá)量卻難以達(dá)到要求。與傳統(tǒng)抗生素相比某些抗菌肽的抗菌活性還不夠理想，改造已有抗菌肽和設(shè)計(jì)新抗菌肽分子是提高活性的有效途徑。這就需要進(jìn)一步研究抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，為抗菌肽分子的改造和設(shè)計(jì)提供足夠的理論依據(jù)。與抗菌肽相關(guān)的某些毒性作用、在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定性等問(wèn)題有待研究。但隨著抗菌肽及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在理論和應(yīng)用上更深入的研究，抗菌肽最終

3、必將對(duì)人類醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。 目的: 通過(guò)將天蠶素A（cecropin A，CA）截短肽的串連融合表達(dá)，降低其對(duì)工程菌的毒性和提高其表達(dá)產(chǎn)量，為其產(chǎn)業(yè)化提供可能的方法。比較CA其兩個(gè)α螺旋區(qū)域的活性是否一樣，兩個(gè)α螺旋和一個(gè)α螺旋的抑菌活性是否有區(qū)別，從而為改造已有抗菌肽和設(shè)計(jì)新抗菌肽分子提高活性的途徑，提供理論依據(jù)。通過(guò)了解CA的抗原性區(qū)域，制備高質(zhì)量抗體，為以后更好的檢測(cè)抗菌肽CA在異源表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況及表達(dá)產(chǎn)量

4、提供幫助。 方法: 1.使用蛋白質(zhì)專家分析系統(tǒng)（ExPASy，http：//www.expasy.org/）的PredictProtein程序分析CA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，PROSITE SCAN程序分析其功能位點(diǎn)。根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)分析，選取氨基酸區(qū)域1～19作為CA19，18～36作為CA36，2～10和25～32通過(guò)GP連接作為CA210。 2.根據(jù)密碼子的偏愛(ài)性設(shè)計(jì)合成3對(duì)反向互補(bǔ)的核苷酸單鏈，并在每條單鏈

5、的3’端加上ATG尾。將3對(duì)核苷酸單鏈分別磷酸化后退火延伸。用連接酶將這3對(duì)核苷酸雙鏈串連為不同拷貝數(shù)的串連體后構(gòu)建于pET-31b（+）載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α進(jìn)行克隆，隨機(jī)挑選菌落經(jīng)PCR后用瓊脂糖鑒定。 3.將鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）上進(jìn)行串連融合表達(dá)，并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件。選擇優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE分析，Western-blot鑒定。 4.表達(dá)產(chǎn)物用親和層析將其純化后，

6、融合蛋白用CNBr切割成單體，通過(guò)復(fù)性、冷凍干燥濃縮等步驟，分離、純化和濃縮抗菌肽，用Tricine SDS-PAGE鑒定抗菌肽的純度和性質(zhì)。 5.用大腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢測(cè)其抗菌活性。用微量稀釋法檢測(cè)其最小抑菌濃度。 6.將部分純化的融合蛋白免疫BLAB/C小鼠，分別在第三、四次免疫一周后斷尾取血，ELISA檢測(cè)其效價(jià)。Western-blot鑒定其特異性。 結(jié)果:

7、 1.將CA19、CA36、CA210的互補(bǔ)DNA雙鏈經(jīng)DNA連接酶作用后，成功構(gòu)建了1～5個(gè)拷貝的串連體。瓊脂糖電泳分析分別在其相應(yīng)分子量的位置有特異性條帶。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α的pET-31b（+）-CA19（CA36、CA210）1～5質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR鑒定、瓊脂糖電泳分析正確后測(cè)序，其插入位置和序列完全正確，成功構(gòu)建了CA各截短肽的串連融合表達(dá)載體。 2.融合蛋白CA19（CA36、CA210）1～5，在37℃、I

8、PTG濃度為0.2mmol、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為第2h加入、誘導(dǎo)3h后得到穩(wěn)定的表達(dá)量，其中CA19-3、CA36-3和CA210-3的表達(dá)量最高，分別為37.5％、39.1％和38.8％。融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，證實(shí)其大小一致，Western-blot鑒定有特異性條帶。 3.親和層析純化后的重組蛋白用BandScan5.0分析其純度均達(dá)90％以上。經(jīng)CNBr切割獲得單體，用Tricine SDS-PAGE鑒定在2kD處可見(jiàn)一條特

9、異的目的條帶。 4.抑菌實(shí)驗(yàn)顯示CA各截短肽對(duì)各革蘭氏陰性菌的抑菌能力強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌，抑菌活性從大到小為CA210>CA19>CA36。此外，通過(guò)微量稀釋法得出各CA截短肽的最小抑菌濃度為16μg/ml～128μg/ml。 5.免疫的小鼠抗血清經(jīng)ELISA檢測(cè)，CA19、CA36、CA210第三次免疫后的效價(jià)，分別為1：2000、1：1000、1：1000，加強(qiáng)免疫后的效價(jià)分別為1：10000、1：500

10、0、1：5000；抗血清用Western-blot鑒定可見(jiàn)特異性條帶。而空載的誘導(dǎo)蛋白抗血清ELISA和Western-blot檢測(cè)結(jié)果均為陰性。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建了基于序列分析的天蠶素A各截短肽串連融合表達(dá)載體，為其不易被原核細(xì)胞工程菌表達(dá)和表達(dá)量低的問(wèn)題，提供了可能的解決途徑。 2.通過(guò)對(duì)天蠶素的序列分析，采用了其兩個(gè)α螺旋區(qū)分別表達(dá)和聯(lián)合表達(dá)，其中含兩個(gè)α螺旋的CA210的抑菌活性最強(qiáng)，而含N端α螺旋的