黃河鯉性別特異片段的鑒定與性能差異cDNA文庫的構(gòu)建及相關(guān)ESTS功能分析.pdf

1、本研究以黃河鯉為實(shí)驗(yàn)材料,選擇220條10bp的隨機(jī)引物、10對(duì)SSR引物及100條ISSR引物,利用RAPD-PCR、SSR-PCR及ISSR-PCR三種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黃河鯉基因組進(jìn)行掃描,試圖發(fā)現(xiàn)一些與黃河鯉性別相關(guān)的連鎖標(biāo)記。SSR結(jié)果顯示,雖然在對(duì)其DNA池進(jìn)行掃描的過程中,在1對(duì)引物的擴(kuò)增譜帶上發(fā)現(xiàn)了1條可能與性別連鎖的疑似條帶,但當(dāng)利用這對(duì)引物在更多的個(gè)體中驗(yàn)證時(shí),沒有發(fā)現(xiàn)其性別特異性;而ISSR結(jié)果表明,在所有篩選出來的1

2、0條引物的擴(kuò)增譜帶上,未發(fā)現(xiàn)與性別連鎖的疑似條帶。
　　 利用RAPD技術(shù)對(duì)黃河鯉雌、雄基因池進(jìn)行掃描的結(jié)果表明,其中的5條隨機(jī)引物的擴(kuò)增譜帶中有疑似性別特異條帶的存在,利用這5條隨機(jī)引物在個(gè)體中進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證,只有隨機(jī)引物S2107的擴(kuò)增產(chǎn)物中存在一條穩(wěn)定的雄性特異條帶。經(jīng)回收、克隆、測序后獲得了一條大小為909bp的候選雄性特異條帶,命名為Ccmfl。BLAST檢索發(fā)現(xiàn)該片段與位于斑馬魚連鎖群1的一段重復(fù)序列(DKEY-24

3、H22)有一定的相似性。
　　 此外,本研究還利用抑制性消減雜交技術(shù),成功構(gòu)建了黃河鯉魚基因組DNA的消減文庫,隨機(jī)挑選150個(gè)克隆經(jīng)巢式引物PCR驗(yàn)證后,獲得88個(gè)陽性克隆,以正、反向二次PCR產(chǎn)物為探針,與88個(gè)陽性克隆質(zhì)粒DNA進(jìn)行Southern dot blotting雜交,從中挑選了22個(gè)候選性別特異陽性克隆進(jìn)行序列測定,經(jīng)特異引物的PCR驗(yàn)證后,獲得了兩個(gè)長度分別為387bp和183bp雄性特異的DNA片段,BLA

4、STN和BLASTX檢索未發(fā)現(xiàn)與其同源的核苷酸和氨基酸序列,將其命名為Ccmf2和Ccmf3。
　　 根據(jù)3個(gè)雄性特異片段的序列分別設(shè)計(jì)特異引物,以管家基因GAPDH為內(nèi)部對(duì)照,雌雄個(gè)體基因組為模板進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,在所有的雄性個(gè)體中均擴(kuò)增出了穩(wěn)定的目的特異性條帶,而雌性個(gè)體中沒有該條帶的出現(xiàn)。由于分離到的三個(gè)片段都與雄性性別連鎖,所以推測黃河鯉的染色體類型應(yīng)該為XX/XY型。
　　 為了進(jìn)一步了解三個(gè)片段的

5、性別特異性,利用特異PCR技術(shù)對(duì)100個(gè)黃河鯉的雌、雄基因組進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cemf1和Cemf2的性別特異性分別為99％和98％;Ccmf3的性別特異性達(dá)到了100％,故3個(gè)雄性特異片段在兩染色體(性染色體和常染色體)間的重組值都很低,可以用于黃河鯉的遺傳性別的鑒別。
　　 分別以Ccmf1、Ccmf2和Ccmf3為探針,與鯉魚的其他三個(gè)品種:野生黃河鯉、建鯉以及豐鯉的基因組進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交(雌、雄各5尾),以期判斷這3

6、個(gè)性別特異片段的分子性別有效性(即雌雄鑒別的效率)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在雌性個(gè)體中,Ccmf1、Ccmf2和Ccmf3的分子性別有效性分別為67％,80％和93％;而在雄性個(gè)體中,其分子性別有效性分別為67％,100％,和73％。充分說明在鯉魚不同種間性染色體的分子類型的多樣性。3個(gè)雄性連鎖標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)與鑒定,能夠作為鑒別黃河鯉遺傳性別以及識(shí)別該魚種性染色體的分子切入點(diǎn),從而為探討該物種性別決定及分化機(jī)制提供依據(jù)。
　　 為了更加全面的了

7、解黃河鯉性腺發(fā)育機(jī)制,本研究還從mRNA水平上,分別以精巢與卵巢互為驗(yàn)證方,成功構(gòu)建了黃河鯉成熟期雌、雄性腺的雙向差減文庫,經(jīng)菌液PCR對(duì)文庫進(jìn)行初步篩選,分別獲得了280個(gè)(來自雄性文庫)和240個(gè)(來自雌性文庫)含有插入片段的陽性克隆;然后利用Southern dot bltting對(duì)隨機(jī)挑選的180個(gè)克隆(雌、雄各90個(gè))在正、反雜交膜上進(jìn)行了鑒定,從中找到了64個(gè)(其中來自雄性文庫21個(gè),雌性文庫43個(gè))候選差異表達(dá)克隆,經(jīng)序列

8、測定后,通過BLASTN和BLASTX對(duì)這些候選差異基因片段進(jìn)行功能分類,得到了50個(gè)ESTS序列。其中雄性文庫的18個(gè)差異ESTS中,包括14個(gè)已知功能的和4個(gè)未知功能的基因片段。按照其功能,14個(gè)ESTS分屬于結(jié)構(gòu)蛋白基因、蛋白質(zhì)翻譯機(jī)制相關(guān)基因、離子通道和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)基因、腫瘤相關(guān)和腫瘤抑制因子及其他基因等;而來自雌性文庫的32個(gè)差異ESTS代表了27個(gè)已知功能基因和5個(gè)未知功能的基因,在已知功能基因中,出現(xiàn)頻率較高的是來自呼吸鏈上的

9、相關(guān)基因片段,以及與蛋白合成有關(guān)的基因片段;除一些未知功能蛋白外,其他的則出現(xiàn)了1次。參照斑馬魚及其他脊椎動(dòng)物基因功能分析,雌性文庫中已知功能EST分屬調(diào)節(jié)因子、結(jié)構(gòu)蛋白、酶類、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)調(diào)控等。
　　 根據(jù)部分同源基因在黃河鯉精、卵巢中的半定量表達(dá)情況,在雄性差異文庫中找到10個(gè)差異表達(dá)基因片段:5個(gè)為精巢特異表達(dá)基因;5個(gè)為精巢高效表達(dá)基因;其中包括2個(gè)首次發(fā)現(xiàn)的未知功能基因。在雌性差異文庫中找到8個(gè)差異表達(dá)基因片段:2

10、個(gè)為卵巢特異表達(dá)基因;6個(gè)為卵巢高效表達(dá)基因,其中包括1個(gè)未知功能基因。
　　 根據(jù)各基因片段的性質(zhì)及編碼功能,選擇了可能參與性腺發(fā)育的3個(gè)基因片段,利用RACE技術(shù)對(duì)其全長進(jìn)行了擴(kuò)增,分別獲得了大小為2173bp、1763bp以及884bp的全長基因,他們分別是Hmwtla基因、HmSetd6基因以及HmPsmb2基因。最后,通過在成體不同組織的半定量和熒光定量表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因均為性腺差異表達(dá)基因,其中Hmwtla

11、基因主要在精巢中表達(dá),HmSetd6基因則主要在卵巢中表達(dá),且表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精巢,而HmPsmb2基因則是卵巢特異表達(dá)基因;通過與脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育相關(guān)基因功能的對(duì)比,推測Hmwtla基因可能是黃河鯉雄性性別發(fā)育的重要調(diào)控基因;Hmsetd6基因則作為表觀調(diào)控基因參與了黃河鯉雌性性狀的發(fā)育;而HmPsmb2基因是在生理上或行為上維持黃河鯉雌性性別的性別偏向基因;這些基因的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)性腺差異表達(dá)EST文庫的構(gòu)建,將對(duì)了解黃河鯉性腺發(fā)育及性別