造血干細(xì)胞移植后巨細(xì)胞病毒感染和GVHD的研究.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植是目前治療來(lái)源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病的重要治療手段,廣泛應(yīng)用于臨床。移植后的巨細(xì)胞病毒感染,移植物抗宿主病等發(fā)生率和死亡率都很高,使得移植成功率降低。如何減輕這些移植后并發(fā)癥提高異基因造血干細(xì)胞移植的效率是目前血液病學(xué)家和免疫學(xué)家共同關(guān)心的問(wèn)題。
　　 第一部分搶先治療異基因造血干細(xì)胞移植后巨細(xì)胞病毒感染的臨床分析
　　 [目的]回顧性研究異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)后搶先治療對(duì)巨

2、細(xì)胞病毒(CMV)感染的臨床意義。[方法]收集上海市第一人民醫(yī)院2001-2008年間進(jìn)行異基因干細(xì)胞移植治療的患者共計(jì)103例,采用熒光定量PCR法檢測(cè)CMV-DNA,并根據(jù)結(jié)果搶先治療CMV相關(guān)疾病,分析搶先治療對(duì)于阻止CMV血癥發(fā)展為CMV相關(guān)疾病的意義。[結(jié)果]103例患者中檢測(cè)出63例次(51例)CMV-DNA陽(yáng)性,發(fā)生率為49.5％,經(jīng)搶先治療19例發(fā)生CMV相關(guān)疾病,發(fā)生率為18.4％。60例次CMV血癥經(jīng)更昔洛韋和(或)

3、鱗甲酸治療轉(zhuǎn)陰,1例不可評(píng)價(jià)療效,治療的總有效率為96.8％(60/62)。CMV相關(guān)疾病的治療總有效率為89.5％(17/19),2例患者因CMV相關(guān)肺炎伴急性移植物抗宿主病(aGVHD)而死亡,CMV相關(guān)疾病的直接死亡率為1.9％(2/103)。[結(jié)論]在不進(jìn)行預(yù)防性治療的前提下,CMV血癥和CMV相關(guān)疾病發(fā)生率未見(jiàn)升高。
　　 第二部分抗原特異性記憶T細(xì)胞不引起GVHD及其機(jī)制研究
　　 [目的]移植物抗宿主病是異

4、基因造血干細(xì)胞移植后的另一種常見(jiàn)并發(fā)癥,由供者T淋巴細(xì)胞介導(dǎo),其發(fā)病率和死亡率都很高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。如何在減輕GVHD的同時(shí)保存T細(xì)胞的GVL功能是目前研究的熱點(diǎn)。幾個(gè)研究小組都證實(shí)非抗原特異性記憶T細(xì)胞不引起GVHD,然而對(duì)于抗原特異性記憶T細(xì)胞在GVHD中的作用卻少有研究。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康募礊檠芯靠棺h特異性記憶T細(xì)胞在GVHD中的作用。[方法]建立野生型動(dòng)物模型和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型來(lái)研究抗原特異性記憶T細(xì)胞在GVHD中的作用。應(yīng)用T

5、Ea→CB6目的GVHD模型研究抗原特異性記憶T細(xì)胞不引起GVHD的機(jī)制。[結(jié)果]建立了兩種野生型動(dòng)物模型,第一個(gè)模型是用BALB/c小鼠致敏C57BL/6小鼠,8周后從C57BL/6小鼠分選出CD62L-TEM移植給BALB/c受鼠,與CD62L+初始T細(xì)胞相比,CD62L-TEM細(xì)胞引起較弱的GVHD。第二個(gè)模型是用C3H/HeJ小鼠致敏C57BL/6小鼠使其受孕,從C57BL/6懷孕母鼠體內(nèi)分選出的記憶T細(xì)胞移植給C3H/HeJ小

6、鼠也只能引起較弱的GVHD。用轉(zhuǎn)基因的TEa小鼠建立了TEa→CB6目的GVHD模型,TEa小鼠中大部分T細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞,特異性識(shí)別ASFEAQGALANIAVDKA肽段,此肽段表達(dá)在CB6F1小鼠細(xì)胞上。將初始TEa細(xì)胞轉(zhuǎn)輸至Rag-1-/-小鼠體內(nèi),然后用CB6F1小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行免疫,8周后轉(zhuǎn)輸?shù)腡Ea細(xì)胞獲得記憶T細(xì)胞表型(即CD44highCD45RB-CD127+CD11abright FasL bright Ki67

7、-CD28-KLRG-),其中93％為CD62L-CD44high TEM表型,7％為CD62L+CD44high TCM表型。將TEM細(xì)胞純化出來(lái),與抗原特異性T細(xì)胞或特異性抗原肽進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。并觀察抗原特異性T細(xì)胞是否引起GVHD,同時(shí)進(jìn)行異基因抗原皮膚移植,對(duì)抗原特異性記憶T細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)追蹤。TEM細(xì)胞cpm值明顯高于初始TEa細(xì)胞,TEM細(xì)胞增殖更快更強(qiáng)。如果移植CB6F1小鼠皮膚到產(chǎn)生TEM細(xì)胞的Rag-1-/-小鼠(

8、TEM小鼠),TEM組皮膚移植物于7天至12天排斥,中位生存時(shí)間為9天；初始TEa動(dòng)物組皮膚移植物7天至23天排斥,中位生存時(shí)間為10天,兩組生存率比較差異顯著(p<0.05)。為了研究TEM在GVHD中的作用,將1×105TEM細(xì)胞與1×107去除T細(xì)胞的骨髓一同移植至致死量照射的CB6F1受鼠,生存分析表明接受TEM細(xì)胞移植組小鼠100天生存率100％,而初始TEa組小鼠35天內(nèi)全部死亡,兩組生存率有明顯差異；體重變化曲線顯示在第7

9、、14及21天初始TEa受鼠組與TEM受鼠組相比體重下降明顯(p<0.01)。移植后第7天進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè),接受初始TEa細(xì)胞移植的GVHD受鼠血漿中IL-2、IL-3、IL-12P40、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IL-1a、IL-1b、MIP-1a、MIP-1b、RANTE、MCP-1、KC、Eotaxin、G-CSF和GM-CSF的水平明顯高于接受TEM細(xì)胞移植的GVHD受鼠(p<

10、0.05)。體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)顯示TEM在培養(yǎng)的前期cpm值高于初始TEa細(xì)胞,而培養(yǎng)后期TEM的cpm值低于初始TEa。CFSE標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞后進(jìn)行AnnexinV和7-AAD流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TEM細(xì)胞與初始T細(xì)胞相比早期凋亡與晚期凋亡均顯著增加,這種趨勢(shì)不依賴(lài)于IL-7的存在。對(duì)移植到CB6F1小鼠體內(nèi)的TEM細(xì)胞進(jìn)行追蹤,分別收集骨髓,肝,脾及淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞,移植后7天檢測(cè)不到TEM細(xì)胞,相反能夠檢測(cè)到大量的初始T細(xì)胞；與此相對(duì)