番茄葉綠體DnaJ蛋白LeCDJ1功能分析.pdf

1、溫度脅迫是番茄在保護(hù)地栽培生產(chǎn)中的主要障礙因素之一。它破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正確空間構(gòu)象，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起植物光系統(tǒng)Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)的光抑制。為了生存，植物進(jìn)化出了許多機(jī)制以適應(yīng)環(huán)境，包括誘導(dǎo)產(chǎn)生熱激蛋白(heat shock protein，Hsp)。DnaJ蛋白是Hsp40家族的一員，是廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的一種分子伴侶。作為Hsp70的輔伴侶分子

2、，它可以獨(dú)自或協(xié)助Hsp70完成蛋白質(zhì)折疊、解折疊和調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物解聚等功能，對(duì)于逆境條件下蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定的維持具有重要作用。因此，探討溫度脅迫下DnaJ蛋白的生理功能對(duì)于揭示番茄等喜溫蔬菜的耐冷機(jī)制及分子基礎(chǔ)，指導(dǎo)喜溫蔬菜抗逆栽培和育種具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了一個(gè)番茄葉綠體定位的DnaJ蛋白基因(LeCDJ1)，并以轉(zhuǎn)正義和反義LeCDJ1的番茄為材料，研究了過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)LeCDJ1對(duì)轉(zhuǎn)基因

3、番茄在溫度脅迫下PSⅡ的穩(wěn)定性及ROS清除能力等方面的影響，主要結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)NCBI查得該基因的全長(zhǎng)mRNA序列（GenBank注冊(cè)號(hào):AK323422.1），通過(guò)DNAman軟件設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR的方法獲得LeCDJ1的全長(zhǎng)cDNA。LeCDJ1全長(zhǎng)814bp，開(kāi)放閱讀框483bp，編碼161個(gè)氨基酸。
　　(2)擬南芥原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)p35S-LeCDJ1-GFP融合蛋白，并通過(guò)Confoca

4、l觀察發(fā)現(xiàn)GFP激發(fā)的綠色熒光和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說(shuō)明LeCDJ1蛋白定位于葉綠體。
　　(3)酵母雙雜交結(jié)果顯示LeCDJ1可以與葉綠體定位的cpHsp70互作。
　　(4)成功構(gòu)建了pET-LeCDJ1原核表達(dá)載體，用IPTG誘導(dǎo)LeCDJ1在大腸桿菌BL21中表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)純化后免疫小鼠，制備抗體，測(cè)得效價(jià)為1∶50000，用于下一步的Western blot。
　　(5) qRT-PCR和

5、Northern雜交分析表明，LeCDJ1基因在葉綠素含量高的組織（葉片）中表達(dá)量較高。同時(shí)該基因的表達(dá)受4℃、38℃、42℃、45℃、NaCl、PEG、MV和H2O2的誘導(dǎo)，其表達(dá)水平隨脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而變化。此外，LeCDJ1的表達(dá)還受到ABA的誘導(dǎo)。
　　(6)將LeCDJ1的編碼區(qū)連入pBI121載體，構(gòu)建了LeCDJ1的過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，獲得正、反義轉(zhuǎn)基因番茄植株，并通過(guò)PCR、qR

6、T-PCR以及Western雜交的方法檢測(cè)具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明成功獲得了LeCDJ1過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株。
　　(7)正常生長(zhǎng)條件下，野生型與正、反義轉(zhuǎn)基因植株表型上無(wú)明顯差別。但是，低溫脅迫條件下，過(guò)表達(dá)株系較野生型能維持較好的生長(zhǎng)表型，較低的細(xì)胞膜受傷害程度，較低的O2-和H2O2含量，說(shuō)明過(guò)表達(dá)LeCDJ1基因提高了番茄植株的抗低溫脅迫能力。
　　(8)低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)正義番茄植株與野生型和

7、反義植株相比，表現(xiàn)出較高的Fv/Fm和較低的qI，說(shuō)明轉(zhuǎn)正義基因番茄PSⅡ的光抑制程度較輕。Western雜交和BN-PAGE分析結(jié)果進(jìn)一步表明，低溫處理后轉(zhuǎn)正義基因番茄的D1蛋白含量以及類囊體膜上的PSⅡ復(fù)合體的穩(wěn)定性也較高。D1蛋白合成抑制劑硫酸鏈霉素(SM)處理的轉(zhuǎn)正義基因番茄的Fv/Fm、D1蛋白含量及PSⅡ復(fù)合體的穩(wěn)定性依然比SM未處理的野生型高，說(shuō)明LeCDJ1對(duì)于PSⅡ的保護(hù)作用至少不僅僅依賴于D1蛋白的從頭合成。