麝香酮對(duì)大鼠原代脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷及急性脊髓損傷保護(hù)的研究.pdf

1、第一部分麝香酮對(duì)原代脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響
　　目的：
　　建立星形膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)械化學(xué)損傷模型，評(píng)估不同濃度的麝香酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用。
　　方法：
　　采用差速貼壁法和短期暴露相結(jié)合的方法獲取脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞。采取2mm間距行“井”法對(duì)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行劃傷，建立星形膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)械模型，在機(jī)械模型中加入500mmol/l谷氨酸共培養(yǎng)，建立星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械-化學(xué)損傷模型，在建立模型后24小時(shí)用盼藍(lán)染

2、色法測(cè)定細(xì)胞死亡率、LDH漏出率的檢測(cè)。對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分組:A組（單純培養(yǎng)），B組（機(jī)械化學(xué)損傷后繼續(xù)培養(yǎng)），C組（機(jī)械化學(xué)損傷后加入3ug/ml麝香酮），D組（機(jī)械化學(xué)損傷后加入6ug/ml麝香酮），E組（損傷后加入12ug/ml麝香酮）。分別在6h、12h、24h、48h、72h作MTT檢測(cè)。在3h、6h、12h時(shí)檢測(cè)SOD、MDA、LDH、TNF-α、細(xì)胞內(nèi)Ca2+。
　　結(jié)果：
　　獲得了95％以上的高純度的脊髓

3、星形膠質(zhì)細(xì)胞。建立了大鼠原代脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械、機(jī)械化學(xué)損傷模型。24小時(shí)A組未見(jiàn)死亡細(xì)胞，在機(jī)械損傷模型死亡率在23.57％;在機(jī)械化學(xué)損傷模型死亡率在36.27％。作MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C、D、E組細(xì)胞損傷程度有所減輕，不同濃度的麝香酮發(fā)揮最強(qiáng)功效的時(shí)間則不同。在24小時(shí)檢測(cè)LDH的漏出B組比A組明顯增加，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而漏出加重，A組無(wú)明顯的變化，C、D、E組都明顯的下降，D組效果最好LDH抑制率(％)達(dá)88.27％。SOD檢測(cè)提示:

4、A組無(wú)明顯的變化，B組明顯的下降，C、D、E組比B組高，以D組在同一時(shí)間點(diǎn)最明顯。MDA檢測(cè)提示A組無(wú)明顯的變化，B組比A組升高，C、D、E組比B組明顯低，D組在同一時(shí)間點(diǎn)最低。TNF-α檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)鈣檢測(cè)與MDA有類(lèi)似的變化。C、D、E組與A組和B組有顯著性差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　成功建立了星形膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)械-化學(xué)損傷模型;不同濃度的麝香酮對(duì)機(jī)械-化學(xué)損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞都有保護(hù)作用，以6ug/ml濃度效果最

5、好。
　　第二部分麝香酮對(duì)原代脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷保護(hù)機(jī)制的探討
　　目的：
　　探討麝香酮對(duì)原代脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分組:A組（C組加6ug/ml麝香酮）;B組（物理化學(xué)損傷模型）;C組（劃傷模型）;D組（B組加6ug/ml麝香酮）;E組(B組加50umol/l MK801);F組（D組加MK801），分別在3h、6h、12h用ELISA法檢測(cè)上清谷氨酸濃度、流式法檢測(cè)細(xì)

6、胞內(nèi)鈣濃度，在6h時(shí)行Q-PCR、western blot檢測(cè)EAAT，ERK1/2、GFAP的mRNA、蛋白的表達(dá)，并在6h、12h、24h、48h觀(guān)察各組的形態(tài)變化。
　　結(jié)果：
　　在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)A組谷氨酸濃度比C組低，B組為最高;D組比B組明顯低，E組比B組低，但高于D組，F(xiàn)組比B、D、E組低(P＜0.001)。在3h、6h、12h用流式法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，A組比C組降，B組為最高，D組比B組低，E組比B

7、組低，但高于D組，F(xiàn)組都低于B、D、E組;3小時(shí)、6小時(shí)P＜0.05;12小時(shí)，P＜0.0001。選用QRT-PCR檢測(cè)EAAT，ERK1/2、GFAP的mRNA的表達(dá)，在EAAT的mRNA對(duì)比值方面，A組比C組低，B組最高，D組比B組明顯降低，E組比B組降低，但高于D組，F(xiàn)組比B、D、A組的E組低;在GFAP的mRNA對(duì)比值方面，A組比C組低，B組最高，D組比B組明顯低;E組比B、D組低，F(xiàn)組最低;在ERK1/2的mRNA對(duì)比值方面與

8、GFAP類(lèi)似，A組最低。western blot檢測(cè)EAAT，ERK1/2、GFAP蛋白表達(dá)與對(duì)應(yīng)的mRNA的趨勢(shì)一樣。GFAP染色:6小時(shí)見(jiàn)明顯的劃傷帶，膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)少，A、C組細(xì)胞體積增大不明顯，未見(jiàn)固縮的細(xì)胞;B、D、E、F組見(jiàn)細(xì)胞增大、偶見(jiàn)核固縮;以B、E組明顯，偶見(jiàn)壞死。12小時(shí)劃傷帶仍明顯，膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)較多，核固縮，在B、D、E、F組出現(xiàn)了壞死，以B組明顯。24小時(shí)劃傷帶隱約可見(jiàn)，細(xì)胞增生、肥大明顯;B組見(jiàn)大量核固縮、壞死;

9、C組偶見(jiàn)核固縮;D組可見(jiàn)劃傷致壞死，增生肥大細(xì)胞少;E組細(xì)胞肥大，核固縮、壞死并存;F組細(xì)胞肥大，可見(jiàn)核固縮。48小時(shí)各組見(jiàn)劃傷區(qū)細(xì)胞肥大明顯，核固縮，A組最輕，C組次之;B組最明顯，核固縮、壞死并存較多，其余組比B組輕。
　　結(jié)論：
　　麝香酮降低了星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上EAAT的mRNA和蛋白的表達(dá)、降低了谷氨酸的濃度，抑制了鈣內(nèi)流，抑制了ERK1/2、GFAP的mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的肥大、增生。
　

10、　第三部分麝香酮對(duì)大鼠急性脊髓損傷保護(hù)的研究
　　目的：
　　評(píng)估麝香酮對(duì)大鼠急性脊髓損傷的作用效果。
　　方法：
　　用Allen's法建立急性脊髓損傷模型，將120只大鼠隨機(jī)分成五組，NS組（生理鹽水組）、MP組（甲基強(qiáng)的松龍組）、MO1組(麝香酮2.5mg/kg)、MO2組(麝香酮5mg/kg)、MO3組(麝香酮10mg/kg)。MO1組、MO2組、MO3組為脊髓損傷后立即分別從尾根靜脈注入2.5mg/kg

11、、5mg/kg、10mg/kg的麝香酮，連續(xù)7天;MP組為術(shù)后立即注入30mg/kg的甲基強(qiáng)的松龍;NS組則注入等量生理鹽水。術(shù)后在3h、8h、1d、3d、1w、2w每組隨機(jī)取4只動(dòng)物，提取血清，ELISA法檢測(cè)SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-a;術(shù)后8h、1d、3d、1w、2w、4w每組隨機(jī)取3只動(dòng)物，切取脊髓組織，行H-E染色、尼氏染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色:GFAP，并計(jì)算每視野觀(guān)察到的膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù)。術(shù)后1d、3d、1w

12、、2w、4w各取1只動(dòng)物Western-Blot法檢測(cè)bcl-2、caspase-3、GFAP的蛋白表達(dá)。所在數(shù)據(jù)并行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立了急性脊髓損傷模型。2、ELISA法檢測(cè)(1)SOD∶ NS組從術(shù)3小時(shí)至1周呈下降趨勢(shì)，在2周時(shí)上升。MP組與麝香酮處理的3個(gè)組，從3小時(shí)逐漸上升在3天達(dá)峰值，后出現(xiàn)下降，在同一時(shí)間點(diǎn)，明顯高于NS組，以MO3組最為明顯，2周時(shí)最明下降，以MO1組最明顯，MP組次之，

13、MO2組仍最高。6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，P＜0.001，所兩兩比較都有顯著性差異。(2) MDA∶ NS組從3小時(shí)上升至1周，在2周時(shí)下降。MO3組值8小時(shí)達(dá)峰值，1天后出現(xiàn)了下降，MP組3天達(dá)峰值，后出現(xiàn)下降。MO1和MO2有MP組的趨勢(shì)，MO2下降最低，各時(shí)間點(diǎn)，P＜0.001。(3) TNF-α∶ NS組從3小時(shí)緩慢上升趨勢(shì)，2周時(shí)出現(xiàn)下降，其余四組在相同時(shí)間點(diǎn)較NS組低，以MO2組最低;MP組在1天時(shí)達(dá)峰值，后緩慢下降。MO3在8小時(shí)達(dá)峰值

14、，后下降。(4)IL-β和IL-6與TNF-α有類(lèi)似的趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)，都低于NS、MP組，P＜0.001。3、病理學(xué)觀(guān)察:HE染色:在建模后8小時(shí)打擊區(qū)下方廣泛的出血、細(xì)胞水腫、固縮，以NS組最明顯，MP組次之，在麝香酮所處理的3個(gè)組中，MO2出血較少，其余兩個(gè)組仍較多。打擊區(qū)下方與中央管間出現(xiàn)了空洞，隨著時(shí)間的推移，出血減少，脊髓組織出現(xiàn)了壞死、溶解，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，1周時(shí)顯著增加，2周時(shí)達(dá)頂峰，后緩慢下降持續(xù)，在4周時(shí)NS組空洞擴(kuò)

15、大，中央管消失，MP組仍見(jiàn)散在的小空洞，部分為膠質(zhì)細(xì)胞增生充填，3個(gè)劑量麝香酮所處理的脊髓空洞基本消失，MO2炎癥反應(yīng)最輕。尼氏染色:8小時(shí)NS組出現(xiàn)較多的膠質(zhì)細(xì)胞，尼氏小體腫大明顯、碎裂、分布不均，神經(jīng)元縮小;MP組尼氏小體腫、聚積，神經(jīng)元縮小，仍較完整;在麝香酮所處理的3個(gè)組中，MO2組神經(jīng)元較多，形態(tài)較正常，尼氏小體分布正常，膠質(zhì)細(xì)胞增生少。隨著時(shí)間的推移，NS組膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元固縮，核碎裂，結(jié)構(gòu)消失，取而代之的是增生的膠質(zhì)細(xì)

16、胞，4周時(shí)見(jiàn)少量殘存神經(jīng)元，固縮明顯。在同一時(shí)間點(diǎn)麝香酮所處理的3個(gè)組中，MO2組神經(jīng)元數(shù)量較多，結(jié)核較完整，仍減少，衛(wèi)星現(xiàn)象不明顯，MO1、MO3組及MP組的神經(jīng)元損傷介于生理鹽水組與MO2組間，衛(wèi)星現(xiàn)象明顯。脊髓后側(cè)角、損傷區(qū)出現(xiàn)類(lèi)似的變化。GFAP染色:NS組1周時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，2周時(shí)達(dá)頂峰，為155.8/視野，后緩慢下降，4周時(shí)102.2/視野，MP組明顯低于NS組，在1周時(shí)達(dá)峰值125.8個(gè)/視野，后緩慢下降，4周91.8

17、/視野，麝香酮處理的3組膠質(zhì)細(xì)胞增呈下降趨勢(shì)，在2周出現(xiàn)輕度上升，同一時(shí)間點(diǎn)低于NS組和MP組，以MO2最低，4周時(shí)47.4/視野。Western-Blot檢測(cè)提示NS組caspase3、GFAP最高，Bcl-2最低，MO3組caspase3、GFAP最低，Bcl-2最高、其余各組在這兩者之間。NS、MP組與MO組各時(shí)間點(diǎn)比較有顯著性差異(P＜0.05)。采用BBB評(píng)分:5個(gè)實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第1、3天，雙下肢功能無(wú)明顯變化，多處0-1級(jí)，雙下

18、肢功能逐漸改善，NS組在4周時(shí)達(dá)8.2，MP組達(dá)13.6，麝香酮處理后三組改善明顯優(yōu)于MP組和NS組，MO2組恢復(fù)最明顯，在2周時(shí)達(dá)10.0，4周時(shí)達(dá)18.6。1d、3d時(shí)，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;1w時(shí)，P＜0.05，NS組與MO1組、MO2組、MO3組有顯著性差異;2w時(shí)P＜0.05，MP組與MO1組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間兩兩比較有顯著性差異;3w時(shí)P＜0.05，NS組、MP組與其余3組間比較有顯著性差異;4w時(shí)P＜0.0