副豬嗜血桿菌細(xì)胞致死膨脹毒素和假定絲氨酸蛋白酶EspPs的致病作用研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬上呼吸道常在條件致病菌，在宿主免疫力低下時(shí)引發(fā)格拉瑟氏病，主要剖檢病變是:多發(fā)性漿液性纖維素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。近年來(lái)該病的發(fā)生導(dǎo)致全球范圍養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。為了有針對(duì)性地制定出高效的綜合防治策略必須對(duì)該菌的分子致病機(jī)理進(jìn)行剖析闡釋。
　　 本研究以HPS細(xì)胞膨脹致死毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)

2、和假定的絲氨酸蛋白酶EspPs(包括EspP1和EspP2)為研究對(duì)象。它們都是HPS中已有報(bào)道的潛在的致病因子。以往對(duì)細(xì)胞膨脹致死毒素的研究多采用體外分析的方法，而體內(nèi)研究的報(bào)道較少，而且在HPS中也沒(méi)有CDT導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的報(bào)道。IgA蛋白酶在逃避宿主天然免疫中發(fā)揮著重要作用，曾在流感嗜血桿菌等細(xì)菌中有報(bào)道，最近發(fā)現(xiàn)某些HPS菌株的分泌蛋白有IgA蛋白酶活性，但是還沒(méi)有在HPS中發(fā)現(xiàn)和流感嗜血桿菌的IgA蛋白酶同源的基因，蛋白結(jié)構(gòu)分析

3、和基因序列分析發(fā)現(xiàn)HPS菌株SH0165中的假定的絲氨酸蛋白酶EspPs有可能是IgA蛋白酶。本研究主要取得的研究結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建cdt基因缺失突變株并研究CDT對(duì)細(xì)胞和豚鼠的致病作用
　　 1.1自然轉(zhuǎn)化法篩選得到cdt基因缺失突變株
　　 本研究用自然轉(zhuǎn)化法在HPS血清4型野生菌株JS0135中篩選到3個(gè)cdt基因缺失突變株，包括JS0135△cdt1、JS0135△cdt2和JS0135△cdt1

4、△cdt2。突變株的構(gòu)建過(guò)程首先要構(gòu)建質(zhì)粒pK18-C1G和pK18-C2K，然后通過(guò)自然轉(zhuǎn)化分別把這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株和野生菌株中，篩選出能共同轉(zhuǎn)化這兩個(gè)質(zhì)粒的菌株JS0135（經(jīng)測(cè)序，這個(gè)菌株基因組上的cdt也是雙拷貝而且和SH0165基因組上的cdt序列相同），經(jīng)過(guò)抗性平皿的篩選，PCR、Western blot、Southern blot等方法的鑒定，這兩個(gè)質(zhì)粒上的慶大霉素抗性盒和卡那霉素抗性盒分別等位替換了JS

5、0135基因組上的cdt1和cdt2。cdt的3個(gè)缺失突變株構(gòu)建成功。
　　 1.2 HPS的CDT引起PK15細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化但不引起PK15細(xì)胞凋亡我們用了三種不同的方法，分別是流式細(xì)胞術(shù)，DNA ladder和細(xì)胞核熒光染色技術(shù)來(lái)檢測(cè)野生菌株的分泌蛋白和cdt基因缺失株的分泌蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。希望通過(guò)野生株和缺失株對(duì)細(xì)胞作用的對(duì)比來(lái)分析HPS的CDT對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。三種不同的方法中，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果說(shuō)明CDT能引起細(xì)

6、胞在培養(yǎng)48～72h時(shí)死亡，這個(gè)過(guò)程較為迅速，凋亡細(xì)胞比例較小;DNA ladder沒(méi)有出現(xiàn)明顯的基因碎裂帶，這一結(jié)果說(shuō)明CDT沒(méi)有引起明顯的PK15凋亡;細(xì)胞核熒光染色只能看到細(xì)胞核膨脹但是沒(méi)有典型的凋亡細(xì)胞核特征——核碎裂現(xiàn)象。以上3種方法共同說(shuō)明CDT引起PK15細(xì)胞膨脹死亡，但是不引起PK15細(xì)胞凋亡。
　　 另外，我們將野生菌株和cdt基因缺失株的分泌蛋白和菌體蛋白分別作用于PK15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)野生菌株的分泌蛋白和菌體蛋

7、白引起細(xì)胞核明顯增大，比對(duì)照組大3～4倍，細(xì)胞大小不均一，數(shù)量減少，細(xì)胞核周圍存在大量空泡，部分細(xì)胞核致密濃染，而基因缺失株則不能，說(shuō)明HPS的CDT能引起PK15細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 1.3 HPS的CDT對(duì)豚鼠的致病作用
　　 以MLD劑量對(duì)2組豚鼠分別腹腔注射野生菌株JS0135及其cdt缺失突變菌株JS0135△cdt1△cdt2，注射后連續(xù)觀察7天發(fā)現(xiàn)，(1)與野生菌株相比，cdt基因缺失株致豚鼠死亡率較低

8、，表明CDT與HPS的毒力相關(guān);(2)野生菌株能引起豚鼠內(nèi)臟器官的病變，主要有肺部充血，大腦充血，胸水腹水增多;(3)在野生菌株感染致死的豚鼠胸水中分離到HPS而cdt基因缺失株感染的豚鼠各臟器未分離到HPS，說(shuō)明CDT與細(xì)菌的侵襲力相關(guān)或與抵抗宿主免疫的能力相關(guān)。
　　 2.假定的絲氨酸蛋白酶EspP1、EspP2具有IgA蛋白酶活性
　　 用血清5型野生菌株CF7066及其3個(gè)espP缺失株（CF7066△espP1