2009年深圳地區(qū)杯狀病毒感染的分子流行病學(xué)特征.pdf

1、背景和目的:諾如病毒(Norovirus,NoV)最早是從1968年在美國諾瓦克市暴發(fā)的一次急性腹瀉的患者糞便中分離的病原,并以發(fā)現(xiàn)地將其命名為諾瓦克病毒(Norwalkvirus,NLVs)。由于該病毒無法進行細胞培養(yǎng),不能建立動物模型,亦沒有敏感的診斷技術(shù),所以在較長時間里(約20年),只能用電鏡進行小規(guī)模的糞便標本檢測。最初,這類病毒以電鏡下的形態(tài)和發(fā)現(xiàn)地點命名和分類,隨著病毒種類的增多,該種命名和分類的方式很容易引起混亂的缺點日

2、趨明顯。目前病毒的分類和命名主要根據(jù)病毒形態(tài)學(xué)、抗原特性、宿主范圍和所致疾病的臨床癥狀,特別是病毒基因組序列和結(jié)構(gòu)以及遺傳學(xué)進化分析的結(jié)果進行。經(jīng)杯狀病毒組研究組(calicivirus study group,CSG)1998年建議,國際病毒分類委員會(theinternational committee on taxonomy of viruses,ICTV)批準,將杯狀病毒分為四個屬,分別是:①Lagovirus:以兔出血病病毒(

3、rabbit hemorrhagic disease virus)為代表；②NoV；③SaV(Sapovirus,SaV)；④Vesivirus:以豬水泡疹病毒(swinevesicular exanthema virus)為代表。其中Lagovirus和Vesivirus感染動物；而NoV和SaV主要感染人,二者又合稱為人類杯狀病毒(Human Calicivirus,HuCV)。
　　 20世紀90年代初,NoV病毒的成功克

4、隆和測序分析,大大推動了杯狀病毒的研究,并且分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展,進一步為NoV的深入研究提供了便利條件,對NoV引起急性胃腸炎(acut gastroenteritis,AGE)的危害和意義逐漸得到了充分認識。NoV作為引起人類AGE爆發(fā)和散發(fā)的重要病原體之一,具有典型季節(jié)相關(guān)性,在世界各地都有廣泛傳播,能夠感染所有的年齡組人群,極易引起爆發(fā),成為難以控制的胃腸炎疾病,極大影響著人群公共健康。NoV的共同特征是:直徑約

5、為26～35nm,無包膜,表面粗糙,球形,呈20面體對稱；可從AGE病人的糞便中分離得到,但不能在細胞或組織中培養(yǎng),也沒有合適的動物模型；基因組為無包裹的單股正鏈RNA病毒,RNA鏈全長約7.7kb,包括3個開放閱讀框(open reading frame,ORFs):ORF1基因全長5100bp,位于基因組中5-5104nt之間,編碼一種具有保守序列的多聚酶非結(jié)構(gòu)蛋白,此結(jié)構(gòu)蛋白可裂解為p48、NTPase、p22、vpg、3c-li

6、ke protein和polymerase6個小蛋白；ORF2基因全長1632bp,位于基因組中5085-6707nt之間,編碼一種分子量約為56KD的衣殼蛋白VP1；ORF3基因全長807bp,位于基因組中6707～7513nt之間,編碼一種約為22.5KD的微小結(jié)構(gòu)蛋白VP2。
　　 NoV具有高度的基因多樣性,被分為5個遺傳組,其中GⅠ、GⅡ、GⅣ僅感染人類,而GⅢ、GⅤ分別感染牛和鼠。GⅠ和GⅡ又至少可以進一步劃分為8和

7、17個基因型,GⅢ分為兩個基因型,另外檢測出新的基因型被定義為GⅡ.b型。NoV之所以具有高度的遺傳多樣性,主要是因為RNA依賴性RNA聚合酶(RNA dependent RNA Polymerase,RdRp)缺乏校正功能而引起核苷酸位點突變以及不同病毒株間基因重組。
　　 SaV屬于HuCV的另一種屬,首次發(fā)現(xiàn)于1976年,也是引起人類AGE爆發(fā)和散發(fā)的重要病原體,在世界各地都有廣泛傳播,能夠感染所有的年齡組人群。由于SaV

8、引起的感染不如NoV嚴重,因此對SaV的重視程度和研究深度也均不如NoV。SaV是一種未被包裹的單股正鏈RNA病毒,其基因組RNA鏈全長約7.3～7.5kb,包括3個開放閱讀框(ORFs)。ORF1編碼結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白,capsid protein)和非結(jié)構(gòu)蛋白(RdRp)；ORF2編碼一種基本小蛋白；ORF3與ORF1交迭,只存在于GⅠ、GⅣ、GⅤ型中,編碼一種未知功能的蛋白。SaV根據(jù)RNA聚合酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)的基因多樣性,可以進

9、一步分為5個遺傳組,其中GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型和GⅤ型主要感染人,GⅢ主要感染豬。
　　 病毒性胃腸炎是世界各國高發(fā)疾病之一,尤其在發(fā)展中國家,因胃腸炎疾病死亡的兒童人數(shù)高于發(fā)達國家。隨著研究的深入,HuCV尤其是NoV的感染在急性非細菌性腹瀉中的地位越來越重要,僅次于RV感染。我國NoV感染十分普遍,優(yōu)勢毒株分布雖各地有所差異,但主要以GⅡ.4型為主,對不同地區(qū)NoV感染型別是否有變異、優(yōu)勢株是否發(fā)生變化的鑒定及分析可以豐富我

10、國NoV的研究資料,對于進一步了解NoV進化具有重要意義。雖然國內(nèi)外對SaV的研究不是很深入,但是近年來的研究數(shù)據(jù)表明由SaV引起的疾病暴發(fā)有增加趨勢。為此,我們對2009年深圳地區(qū)腹瀉患者HuCV的流行情況及型別進行了研究,以了解當?shù)豊oV和SaV基因型別分布特征,探討流行的優(yōu)勢毒株；分析深圳地區(qū)HuCV的流行特征,豐富南方腹瀉病毒感染的相關(guān)資料,為我國腹瀉感染提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)和流行病學(xué)背景資料。
　　 方法:
　　

11、 1.以深圳龍崗中心醫(yī)院、北大深圳醫(yī)院、龍華人民醫(yī)院和西鄉(xiāng)人民醫(yī)院等醫(yī)院為監(jiān)測哨點醫(yī)院,按監(jiān)測方案要求采集病毒性腹瀉病例糞便標本。收集2009年病毒性腹瀉患兒糞便標本,每份標本取樣5～10g或5～10ml。病毒性腹瀉病例定義為大便次數(shù)≥3次/d,呈水樣、蛋花樣或稀糊樣便,常規(guī)鏡檢WBC<15,RBC=0,排除常見細菌、寄生蟲等感染的腹瀉病例。
　　 2.對所有標本進行核酸提取,用三對分型引物GISKF/GISKR、COG2F/G

12、ⅡSKR和SLV5317/SLV5749一步法三重RT-PCR擴增NoV和SaV的衣殼區(qū)(Capsid),PCR產(chǎn)物純化回收、測序,應(yīng)用BLAST將測序結(jié)果在GenBank上尋找與各株同源序列,應(yīng)用Clustal W進行多序列對比分析和MEGA4.0構(gòu)建遺傳進化樹,進行NoV和SaV基因型別分析,判斷NoV和SaV流行優(yōu)勢株。
　　 3.運用統(tǒng)計軟件SPSS17.0對收集的患者資料進行統(tǒng)計分析(卡方檢驗),分析深圳地區(qū)杯狀病毒感

13、染的流行概況。
　　 結(jié)果:
　　 1.深圳地區(qū)HuCV感染全年均可發(fā)病,NoV感染主要發(fā)生在5-10月份,SaV感染主要發(fā)生在春秋冬季節(jié)；NoV和SaV感染在不同月份之間存在差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。NoV和SaV感染檢出率在不同性別和年齡段之間沒有顯著性差異。
　　 2.本研究對收集的852份腹瀉患者糞便樣本進行檢測,共檢出67株NoV GⅡ型,檢出率為7.86％；3株NoV GⅠ型,檢出率為O.35％；對隨機抽

14、取的32株NoV GⅡ型和3株GⅠ型樣本,分別進行遺傳進化分析:其中22株屬于NoV GⅡ.4型,6株屬于NoV GⅡ.3型,2株屬于NoV GⅡ.12型,GⅡ.2型和GⅡ.14型各有一例；3株NoV GⅠ型分屬于三個型別:GⅠ.1、GⅠ.3和GⅠ.4型。
　　 3.16株測序SaV樣本中8株屬于G1型(3株為GⅠ.1,5株為GⅠ.2),7株屬于GⅣ型,1株屬于GⅡ.1型。
　　 4.JB030920397和JB0309

15、20633兩株不能歸為現(xiàn)存的NoV GⅡ.3亞型a～c,為新發(fā)現(xiàn)的GⅡ.3亞型；SaV GⅣ型為國內(nèi)首次報道的SaV基因型別。
　　 結(jié)論:深圳地區(qū)HuCV感染全年均可發(fā)病,NoV感染主要發(fā)生在夏季,SaV感染主要發(fā)生在春秋季節(jié)；NoV和SaV感染除了在不同月份之間有統(tǒng)計學(xué)意義,在不同性別和年齡段之間沒有顯著性差異,無統(tǒng)計學(xué)意義；深圳地區(qū)存在NoV GI和GⅡ型感染,HuCV流行優(yōu)勢毒株為NoV GⅡ.4型,本研究發(fā)現(xiàn)了兩株新的