靈芝多糖肽對P-糖蛋白影響的研究.pdf

1、一、目的
　　 研究靈芝多糖肽對Caco-2細胞上P-糖蛋白表達和功能的影響，以及靈芝多糖肽對羅丹明123(P-糖蛋白底物)在Caco-2單層細胞模型上跨膜轉(zhuǎn)運的影響。
　　 二、方法
　　 1細胞培養(yǎng)及形態(tài)學驗證
　　 人結(jié)腸癌細胞(Caco-2)采用DMEM高糖培養(yǎng)基，臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304)采用RPMI-1640培基，細胞免疫熒光法進行P-糖蛋白表達驗證。
　　 2細胞毒性實驗

2、　　 用MTT(苯基溴化四氮唑藍法)分別考察靈芝多糖肽、環(huán)孢素、維拉帕米對Caco-2細胞的細胞毒性影響，選擇細胞存活率選大于90％的濃度作為最大無毒劑量進行下一步細胞實驗。
　　 3靈芝多糖肽對P-糖蛋白功能的影響用流式細胞儀測定Caco-2細胞中P-糖蛋白底物羅丹明-123的熒光強度，維拉帕米為陽性對照，考察靈芝多糖肽對P-糖蛋白功能的影響。
　　 4靈芝多糖肽對P-糖蛋白表達的影響
　　 藥物與Caco-

3、2細胞作用72h后，用流式細胞儀測定細胞內(nèi)抗體的熒光強度，以環(huán)孢素作為陽性誘導作用對照，不干預處理的Caco-2細胞作為陰性對照，分析靈芝多糖肽對P-糖蛋白表達的影響。
　　 5靈芝多糖肽對羅丹明-123轉(zhuǎn)運的影響
　　 在建好的Caco-2細胞單層模型上研究羅丹明-123雙向跨膜轉(zhuǎn)運，以維拉帕米作為陽性對照組，考察靈芝多糖肽對羅丹明-123跨膜轉(zhuǎn)運功能的影響。
　　 三、結(jié)果
　　 1細胞培養(yǎng)及形態(tài)學驗

4、證
　　 ECV304細胞和Caco-2細胞在正常情況下生長迅速;Caco-2細胞高表達P-糖蛋白，適用于研究靈芝多糖肽對P-糖蛋白功能、表達的影響;ECV304細胞極低表達P-糖蛋白，可作為陰性對照細胞。
　　 2細胞毒性試驗
　　 MTT實驗結(jié)果顯示靈芝多糖肽對Caco-2細胞的最大無毒濃度為100μg/mL，0.01-100μmol/L維拉帕米、0.01-10μmol/L環(huán)孢素A對細胞無明顯毒性，由Caco

5、-2細胞確定的各組藥物濃度對陰性對照ECV304細胞也無細胞毒性。因此選用0.1-100μg/mL的靈芝多糖肽進行實驗研究。
　　 3靈芝多糖肽對P-糖蛋白功能的影響
　　 與陰性對照組對比研究發(fā)現(xiàn)，藥物與細胞作用1h后，10、20、50、100μg/mL的靈芝多糖肽能抑制Rh-123的外排，外排量降低了8％、16％、19％、33％(p＜0.05)，具有濃度依賴性。
　　 4靈芝多糖肽對P-糖蛋白表達的影響

6、>　　 在蛋白水平上，細胞與藥物共同作用3天后，高、中濃度實驗組(100、50μg/mL)細胞內(nèi)的抗體熒光強度低于陰性對照組(P＜0.05)，分別降低了10.6％、7.6％。低濃度組(20μg/mL)抗體熒光強度較陰性對照組相比沒有統(tǒng)計學意義。表明較高濃度的靈芝多糖肽能降低Caco-2細胞上P-糖蛋白的表達，與功能實驗結(jié)果具有一致性。
　　 5靈芝多糖肽對羅丹明-123轉(zhuǎn)運的影響
　　 羅丹明-123在Caco-2細胞

7、上雙向跨膜轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果表明，藥物干預3小時后，與陰性對照組Rh-123組相比，高、中(50，100μg/mL)濃度組Rh-123從BL-AP側(cè)的滲透系數(shù)(Papp)下降，外排率較陰性對照組降低了15％、18％(p＜0.05)。說明靈芝多糖肽對P-糖蛋白有一定的抑制作用，與功能實驗結(jié)果一致。
　　 四、結(jié)論
　　 1靈芝多糖肽短時間(1h)內(nèi)可抑制Caco-2細胞上P-糖蛋白的活性，長期應用高、中濃度的靈芝多糖肽(3d)可

8、抑制P-糖蛋白的表達。提示靈芝多糖肽與P-糖蛋白底物合用時，可能會發(fā)生藥物相互作用。靈芝多糖肽可使P-糖蛋白底物在細胞內(nèi)濃度增加，推測靈芝多糖肽與抗腫瘤藥共同使用可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥現(xiàn)象，提高療效。
　　 2高、中濃度的靈芝多糖肽對羅丹明-123(Rh-123)在Caco-2細胞上的雙向跨膜轉(zhuǎn)運有一定的抑制作用，而低濃度靈芝多糖肽對Rh-123雙向跨膜轉(zhuǎn)運無明顯影響，提示靈芝多糖肽可能對P-糖蛋白親和力不高，是否為P-糖蛋白底物需要進