BDNF-TrkB通路在海馬腦片培養(yǎng)中的神經(jīng)再生研究.pdf

1、目的:
　　在哺乳動物大腦，可增殖的神經(jīng)祖/神經(jīng)干細胞在適當?shù)那闆r下可產(chǎn)生新的神經(jīng)元并將其整合到現(xiàn)有的神經(jīng)元環(huán)路，這一過程的存在稱為神經(jīng)再生，它可通過操縱內源性神經(jīng)祖細胞的增殖和分化來提高細胞替代治療各種神經(jīng)退行性疾病的可能性。因此破解出調節(jié)神經(jīng)再生的“合適條件”，使得內源性神經(jīng)替代系統(tǒng)轉化為治療干預措施顯得格外重要。
　　生長因子是神經(jīng)干細胞發(fā)揮功能的重要影響因素。在活體和培養(yǎng)系統(tǒng)內，多種細胞外生長因子已被證明可促進神經(jīng)祖

2、細胞的增殖和神經(jīng)再生。神經(jīng)營養(yǎng)因子屬于生長因子家族，包括神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，neurotrophin-3(NT-3)和neurotrophin4/5(NT-4/5)，可參與神經(jīng)祖細胞的生存和增殖，在新生神經(jīng)元的分化和遷移過程中的自我修復中起重要作用。其中，BDNF因為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富、分布最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子而最為引人關注。BDNF幾乎調節(jié)了神經(jīng)元發(fā)育和功能的所有方面，包括誘導、增殖及分化。

3、BDNF通過特異性結合和激活酪氨酸激酶受體(TrkB)，或一個單一的泛神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)發(fā)揮作用。目前認為BDNF-TrkB信號在神經(jīng)再生中起重要作用。在大腦的不同區(qū)域，BDNF或TrkB通過遺傳或化學方法發(fā)生功能性變化積極參與神經(jīng)再生的過程。體外，BDNF促進神經(jīng)祖細胞的增殖，在神經(jīng)細胞球培養(yǎng)中可增加神經(jīng)元含量。盡管如此，BDNF如何促進神經(jīng)再生，以及BDNF是如何影響神經(jīng)前體細胞的增殖和分化目前仍未能達成共識。

4、　　與之前的報道不同的是，我們用海馬組織型切片培養(yǎng)(OHSCs)來探明BDNF對神經(jīng)再生的影響。與傳統(tǒng)的離體神經(jīng)再生研究的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)相比，OHSCs似乎更適合研究體外新生和成年期的神經(jīng)再生，因為OHSCs包含各種神經(jīng)元和非神經(jīng)元物質，與生理條件更相近;此外，OHSCs可在數(shù)周內保留大部分解剖通路、纖維聯(lián)系和內在功能活性，可維護內源性神經(jīng)元祖細胞自發(fā)生成新的神經(jīng)元，可以更好的模擬在體生理功能。與在體研究相比，用OHSCs可以以在體無法

5、達到的BDNF濃度進行精確的實驗操作，并避免體內BDNF不能通過血腦屏障的缺點更直觀的觀察其藥理作用，是很適合研究研究神經(jīng)再生的載體。因此，在本研究中我們應用OHSCs研究BDNF對神經(jīng)再生的影響。
　　目前為止，只有少數(shù)生長因子，諸如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)在OHSCs上顯示出對神經(jīng)再生的復雜影響。此外，現(xiàn)有研究強烈提示BDNF和其關聯(lián)的受體TrkB參與調節(jié)了神經(jīng)再生過程。因此，我們使用OHSC

6、s來研究BDNF對神經(jīng)再生的影響，用5-溴脫氧鳥苷(BrdU)標記法研究培養(yǎng)海馬腦片的神經(jīng)再生能力。神經(jīng)細胞的神經(jīng)元成熟由兩個神經(jīng)元標記物雙腎上腺皮質激素(DCX)和神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)表示。通過計算由這兩個標記物標記的陽性細胞，我們試圖在OHSCs系統(tǒng)中重新評估BDNF對神經(jīng)再生的影響，并探討B(tài)DNF-TrkB的濃度及時長選擇是否為神經(jīng)再生的關鍵因素之一。
　　在成年哺乳動物大腦的神經(jīng)生長中心中，有自我更新能力的神經(jīng)干

7、細胞(NSCs)聚集于室管膜下區(qū)(SVZ)和海馬顆粒下層(SGZ)。最近的研究表明，BDNF-TrkB對腦缺血可發(fā)揮神經(jīng)保護作用，可顯著促進由缺血誘導的神經(jīng)再生，尤其是在海馬SGZ。腦缺血可引起海馬神經(jīng)元死亡，也可引起反應性細胞增殖和神經(jīng)再生增加，這被認為是神經(jīng)元丟失的補償機制。缺血誘導的神經(jīng)再生機制仍不甚明了，需更多證據(jù)闡明。OHSCs系統(tǒng)是研究缺血誘導的神經(jīng)再生的方便而可靠的工具。離體研究中，可以用氧葡萄糖剝奪技術(OGD)對OHS

8、Cs造成類似于缺血引起的損傷。本研究中，我們首次設計了一系列實驗來證實OGD誘導的神經(jīng)再生。缺血誘導損傷的強度與神經(jīng)再生程度是否有關仍未確定，我們對培養(yǎng)腦片施以不同持續(xù)時間的OGD來誘導出正常、輕度及重度損傷，試圖明確損傷強度和缺血誘導神經(jīng)再生之間的關系。鑒于BDNF-TrkB信號對控制缺血誘導神經(jīng)再生的重要性，我們進一步監(jiān)測了OGD誘導損傷后BDNF和TrkB在OHSCs的表達，了解神經(jīng)元損傷后BDNF-TrkB信號的變化及其與神經(jīng)再

9、生的相關性。
　　方法:
　　動物
　　本研究所用C57BL小鼠來自于廣東省實驗動物中心。所有操作及飼養(yǎng)均遵循人道原則盡量減少動物的痛苦及使用數(shù)量。符合廣東省實驗動物管理條例并通過實驗動物倫理委員會審核。
　　腦片培養(yǎng)
　　海馬腦片培養(yǎng)準備如既往研究所述，并稍做改進。取產(chǎn)后6天幼鼠，斷頭取腦，分離海馬，迅速置于預冷的人工腦脊液(aCSF)中，此液配方為:NaCl118mM,KCl2.5 mM, MgSO43

10、 mM, NaH2PO41.1 mM, NaHCO326 mM,CaCl21 mM和葡萄糖11mM（所有試劑購自美國Sigma公司），置于95％O2/5％ CO2飽和氣體中。隨后，用切片機(MA752，Campden儀器公司)切400μm厚冠狀切片，取相鄰的背側海馬冠狀切片，每個培養(yǎng)板中放入1-2片以待培養(yǎng)。
　　結果:
　　1.海馬腦片培養(yǎng)中的神經(jīng)再生
　　為尋找一個更加優(yōu)化的BrdU標記方法，本研究對文獻報道的Br

11、dU標記方法進行比較。我們應用兩種方案給予BrdU:1）方案1，僅在取腦前對活體動物進行單次的給藥(BrdU，50mg/kg);2)方案2，在方案1的基礎上在腦片體外培養(yǎng)階段給予0.5 uMBrdU處理3天（DIV0至DIV3）。兩種方案均在DIV16后進行腦片固定，利用抗BrdU抗體進行免疫熒光標記，結合神經(jīng)元標志物DCX、NeuN和星型膠質細胞標志物GFAP進一步分析新生細胞的類型。用方案1標記BrdU，大于70％BrdU+細胞分布

12、于齒狀回的顆粒細胞層(GCL)，其余細胞主要散在分布于門區(qū)、CA1和CA3區(qū);用方案2標記BrdU， BrdU+細胞彌散于整個腦片，陽性細胞數(shù)大量增加。為了證實我們的推測，我們應用星型膠質細胞標志物GFAP與BrdU進行雙重標記。應用標記方案2，每個腦片大約有213±29個BrdU+細胞，大量BrdU+(＞85％)細胞表現(xiàn)為GFAP陽性。
　　2.BDNF-TrkB信號與神經(jīng)再生的關系
　　目前，BDNF在海馬腦片中的神經(jīng)再

13、生作用尚未見報道。因此，為了闡明BDNF在細胞增殖與分化的作用，我們應用上述BrdU標記方案2，在培養(yǎng)過程中加入梯度濃度的BDNF（1，10，20，40，80，160，320 ng/mL），在培養(yǎng)16天后(DIV16)進行免疫熒光雙標記鑒定，以研究BDNF對神經(jīng)元的影響。不同的免疫標志物(NeuN，DCX，GFAP)分別與BrdU進行雙重標記，對雙重標記的細胞進行計數(shù)。BDNF的補充導致BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+細胞數(shù)

14、增加，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。與對照組相比，高濃度(40～320 ng/mL)補充BDNF導致的新生神經(jīng)元細胞數(shù)增加有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，n=6)，峰值響應在80 ng/mL。BrdU+/DCX+細胞數(shù)量是BrdU+/NeuN+細胞數(shù)量的3～4倍。分析新生的BrdU+/GFAP+星形膠質細胞的數(shù)量，在不同濃度BDNF補充的培養(yǎng)基中沒有看到顯著變化(P＞0.05，n=6)。
　　我們進一步用特異性酪氨酸激酶TrkB抑制劑K252

15、a和BDNF清除劑TrkB-IgG阻斷BDNF-TrkB信號以明確BDNF的作用。結果表明，BDNF-TrkB信號的雙封閉雖然不能完全消除補充BDNF的影響(與對照組相比P＜0.05，n=6)，但可削弱新生神經(jīng)元數(shù)量的增加（將BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+細胞數(shù)匯總，與80 ng/mL BDNF相比p＜0.05，n=6）。為了解內源性BDNF在神經(jīng)再生的重要性，我們用K252a和TrkB-IgG處理腦片，并且不補充外源性B

16、DNF。結果表明K252a對腦片的存活沒有影響，但與對照組相比可顯著降低神經(jīng)再生。
　　結論:
　　1.海馬腦片培養(yǎng)是研究神經(jīng)再生的一個重要工具。
　　2.外源性補充BDNF可成濃度依賴地促進海馬腦片培養(yǎng)的新生神經(jīng)元生成。
　　3.阻斷內源性或外源性的BDNF均可抑制海馬腦片培養(yǎng)的新生神經(jīng)元生成。
　　4.海馬腦片培養(yǎng)過程中內源性BDNF與TrkB蛋白表達是動態(tài)變化的。在培養(yǎng)早期，內源性BDNF相對不足。<

17、br>　　5.外源性補充BDNF的促神經(jīng)再生作用具有時機性。在培養(yǎng)早期給予外源性BDNF補充最為關鍵，可能與培養(yǎng)早期的內源性BDNF相對不足有關。
　　6.在海馬腦片中給缺氧缺糖處理后，細胞存在不同程度的損傷，并在損傷后的修復期新生神經(jīng)元增加。
　　7.培養(yǎng)的海馬腦片給予不同維持時間的缺氧處理，細胞損傷水平與處理時間成正相關。細胞損傷較小時，誘導生成的新生神經(jīng)元數(shù)量也較小。細胞損傷過大，培養(yǎng)的海馬腦片的新生神經(jīng)元數(shù)量并未相應