大腸不耐熱腸毒素B亞單位作為佐劑的分子機(jī)理研究.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素 B亞單位是一種非常有效的粘膜免疫佐劑，它能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。LTB通過(guò)與細(xì)胞表面的 GM1結(jié)合，不僅能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答效應(yīng)，還能夠改變粘膜免疫應(yīng)答的類(lèi)型。LTB的免疫調(diào)節(jié)作用包括促進(jìn) Th1和 Th2型細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞因子的表達(dá)，CD8+ T細(xì)胞的凋亡和 CD4+ T細(xì)胞的增殖；使 B細(xì)胞活化的 MHCⅡ、ICAM-1、CD25、CD40分子表達(dá)增加，影響 B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的抗原處理和遞呈

2、過(guò)程。但在巨噬細(xì)胞的具體免疫機(jī)制尚不清楚，本文將在這方面進(jìn)行研究。
　　目的：從 LTB處理的 RAW264.7細(xì)胞中，篩選與 LTB有相互作用的蛋白質(zhì)分子，并通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其與 LTB佐劑活性的相關(guān)性；并利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)它們的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，最終探索LTB作為免疫佐劑的分子機(jī)理。
　　方法：(1)在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)含 His-tag的 LTB融合蛋白，用鎳磁珠純化。(2)復(fù)性后的 LTB融合蛋白去除內(nèi)毒素，

3、然后處理RAW264.7細(xì)胞。(3)提取 LTB處理后 RAW264.7細(xì)胞總蛋白，用pull down的方法，分離與 LTB有相互作用的蛋白分子。(4) PAGE檢測(cè)分離得到的蛋白分子，并收集該蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。(5)運(yùn)用生物信息軟件從質(zhì)譜鑒定結(jié)果中篩選出可能的相互作用蛋白分子，并對(duì)其進(jìn)行功能性分析和信號(hào)通路分析，構(gòu)建出這些蛋白分子相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出有意義蛋白分子。(6)免疫熒光驗(yàn)證這些分子在細(xì)胞內(nèi)與 LTB相互作用。(7)

4、Western blot檢測(cè)下游分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)通過(guò)pull down捕獲到與LTB有相互作用的蛋白分子，并通過(guò)質(zhì)譜鑒定了這些蛋白分子。(2)通過(guò)對(duì)這些蛋白分子進(jìn)行生物學(xué)分析后，篩選出 junction plakoglobin、heat shock protein1、carbamoyl-phosphate synthetase1、vimentin等25種有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白分子。(3)通過(guò)對(duì)25種蛋白分子進(jìn)行功能及其信

5、號(hào)通路分析(3)免疫熒光結(jié)果顯示， Vimentin在生理狀態(tài)下不能與 LTB相互作用，而GM130在細(xì)胞內(nèi)與LTB有相互作用，表明LTB在細(xì)胞內(nèi)是以?xún)?nèi)吞小泡的形式運(yùn)輸?shù)摹?4) Western blot檢測(cè)顯示， LTB處理RAW264.7細(xì)胞12 h后，β-actin表達(dá)上調(diào)，Hspd1表達(dá)無(wú)變化，表明LTB與Actb確實(shí)存在相互作用。
　　結(jié)論：通過(guò)質(zhì)譜鑒定結(jié)果和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，我們可以推測(cè) LTB通過(guò)與免疫細(xì)胞表面 GM1結(jié)